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地方品种BR鸡原种鸡群禽白血病的监测及其检测材料的对比评估

作　者: 王秀臻
导　师: 孙淑红
学　校: 山东农业大学
专　业: 兽医
关键词: 禽白血病 BR鸡 ALV的监测评估检测材料结果对比
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)是一类能够引起鸡的可传播的良性和恶性肿瘤以及引起亚临床感染并导致生长迟缓、产蛋下降和免疫抑制的反转录病毒。近几年，禽白血病已在中国地方品种鸡中广泛传播，对地方品种资源的安全构成了严重的威胁，并给地方品种鸡群的保种和选育工作带来了极大的挑战。目前，中国现阶段常用的ALV净化方案为：采集核心母鸡卵白和公鸡泄殖腔棉拭子用ELISA试验直接检测ALVp27抗原，采集ALVp27抗原阳性鸡只的血清接种DF1培养9d后检测ALVp27抗原，血清ALV阳性者全部淘汰。由于被检测的材料来源不同以及样品的处理方法不同,可能造成检测结果对种鸡带毒状态的真实反映程度不同，从而影响鸡群的净化效果。本研究通过ALV感染率检测、ALV感染的多态性调查、病变组织的抗原定位检测、病毒的细胞培养与IFA检测及PCR方法鉴定，评估了中国地方品种BR鸡AL的感染状态，并探究了ALV感染对BR鸡的危害；同时对地方品种BR鸡核心鸡群的不同样品和同一样品不同处理方法的ALVp27抗原的ELISA检测结果与我国目前ALV常用净化方案进行对比研究。研究结果表明，地方品种BR鸡原种鸡群同时存在外源性ALV-J和内源性ALV-E的共感染，且ALV-J与ALV-E共感染严重影响百日鸡的生产性能；而采用我国目前常用ALV净化方案检测公鸡ALV时存在漏检情况，需增加对精液ALVp27抗原的直接检测与接种细胞培养后的检测，直接检测时母鸡的卵白和泄殖腔棉拭子两种样品不能相互替代，均需检测。1BR鸡原种鸡群禽白血病的监测评估及危害评定BR鸡形成历史较早，是当地传统饲养的蛋肉型鸡品种，肉质鲜美，百日龄左右开产，生产性能稳定，年产蛋量在130到180枚之间，产蛋质量好，蛋品的口感和风味俱佳。然而作为中国著名的地方品种鸡，近年来正受到禽白血病日益凸显的影响。采集BR鸡原种鸡群391份公鸡泄殖腔棉拭子和1147枚母鸡鸡蛋，检测鸡群鸡禽白血病病毒（ALV）的感染率；剖检10只送检病鸡，采用IFA法对肝、卵巢组织切片和细胞培养飞片中的ALV进行检测；提取1份ALV阳性的CEF前病毒cDNA，通过PCR方法用针对ALV的A~E亚群的特异性引物、ALV-J的引物对病毒进行鉴定；同时跟踪165日龄原种母鸡连续一周的体重、蛋重和产蛋数，以探究AL感染对原种母鸡生产性能的影响。结果发现BR鸡原种鸡群公鸡泄殖腔棉拭子和母鸡卵白中p27抗原阳性率分别为36.6%（143/391）和10.7%（118/1147）；IFA法发现肝、卵巢组织切片中存在ALV-J和ALV-A的阳性信号；10只病鸡抗凝血离心取白细胞接种CEF培养9d后IFA法检测ALV-J和ALV-A阳性率为60%（6/10）和70%(7/10)；PCR鉴定结果表明BR鸡分离株BR09同时存在ALV-J（BR09J）与ALV-E（BR09E）的共感染；165日龄的原种母鸡群中，ALV阴性鸡的体重与蛋重分别比阳性鸡重73.47g和1.77g，但差异不显著（P>0.05），103只ALV阴性鸡的产蛋数平均每天高于阳性鸡15枚，差异极显著（P<0.01）。结果表明中国优质地方品种BR鸡原种鸡群同时存在外源性ALV-J和内源性ALV-E的共感染；并且ALV-J与ALV-E共感染严重影响百日鸡的生产性能。2鸡群中禽白血病净化所用检测材料的比较研究拟对净化鸡群中禽白血病所用检测材料进行改进和比较，以补充中国现阶段ALV净化方案中所用检测材料。随机取地方品种BR鸡发病鸡群的公鸡和母鸡各23只，分别采集每只公鸡的精液、泄殖腔棉拭子、无菌抗凝血和每只母鸡的卵白、泄殖腔棉拭子、无菌抗凝血。用ELISA试剂盒对不同样品中的ALV p27抗原进行直接检测；同时将各样品接种DF1细胞，培养9d后检测ALVp27抗原。结果显示：对于公鸡而言，经直接检测，其精液中ALVp27抗原阳性率最高(47.8%)，其次为血清(39.1%)，而泄殖腔棉拭子最低(30.4%)；但ALV阳性精液不能完全涵盖血清和泄殖腔棉拭子中的ALV阳性样品；经接种DF1培养后检测，23份血清的ALVp27抗原阳性率为21.7%，高于精液(17.4%)与泄殖腔棉拭子(17.4%)，但ALV阳性血清不能完全包含精液中的ALV阳性样品。对于母鸡而言，经直接检测，其泄殖腔棉拭子与卵白中的ALVp27抗原阳性率相同，均为73.9%，但阳性样品并不一致；经接种DF1培养后检测，23份血清的ALVp27抗原阳性率最高，为13.0%，而且包含卵白(4.3%)与泄殖腔棉拭子(0%)中的所有阳性样品。本研究结果表明：采用中国现阶段ALV净化方案检测公鸡ALV时存在漏检情况，需增加对精液ALVp27抗原的直接检测与接种细胞培养后的检测；直接检测时，母鸡的卵白和泄殖腔棉拭子两种样品不能相互替代，均需检测。本研究探讨了净化鸡群中禽白血病用检测材料和材料处理方式的选择，为生产实践提供借鉴。

全文目录

符号及缩略词说明  4-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-13
1 引言  13-24
  1.2 病原学  14-16
    1.2.1 形态学  14
    1.2.2 病毒基因组及复制方式  14-15
    1.2.3 病毒的分类  15-16
    1.2.4 理化特性  16
  1.3 流行病学  16-17
  1.4 临床特征  17-18
  1.5 致肿瘤机制  18-19
  1.6 免疫抑制及免疫抑制病毒  19-20
    1.6.1 免疫抑制  19
    1.6.2 免疫抑制病毒混合感染现状  19-20
  1.7 ALV 的检测和诊断  20-22
    1.7.1 病毒的分离与鉴定  20-21
    1.7.2 双抗夹心 ELISA  21
    1.7.3 聚合酶链式反应（PCR）  21-22
  1.8 禽白血病在我国的流行现状及发展趋势  22-23
  1.9 防制  23-24
  1.10 研究目的和意义  24
2 材料与方法  24-33
  2.1 材料  24-27
    2.1.1 仪器设备  24-25
    2.1.2 分子生物学试剂  25
    2.1.3 相关试剂  25-26
    2.1.4 鸡胚成纤维细胞（CEF）及 DF1 细胞  26
    2.1.5 病料的来源  26-27
  2.2 方法  27-33
    2.2.1 BR 鸡原种鸡群禽白血病的监测评估及危害评定  27-31
    2.2.2 鸡群中禽白血病净化所用检测材料的比较研究  31-33
3 结果  33-41
  3.1 BR 鸡原种鸡群禽白血病的监测评估及危害评定  33-37
    3.1.1 泄殖腔棉拭子和卵白 ALV 的感染率检测结果  33
    3.1.2 BR 鸡原种鸡群 ALV 感染的多态性检测结果  33-34
    3.1.3 送检病鸡的临床症状  34-35
    3.1.4 病变组织 ALV-J 的抗原定位结果  35
    3.1.5 ALV 的细胞培养与检测结果  35-36
    3.1.6 PCR 方法对鸡群中不同亚型 ALV 的鉴定结果  36-37
    3.1.7 ALV 感染对百日鸡生产性能的影响  37
  3.2 鸡群中禽白血病净化所用检测材料的比较研究  37-41
    3.2.1 BR 公鸡精液、泄殖腔棉拭子、血清 3 种样品 ALVp27 抗原直接检测的比较结果25  37-38
    3.2.2 同一只 BR 公鸡的精液、泄殖腔棉拭子、血清 3 种不同样品接种 DF1 细胞培养后 ALVp27 抗原检测的比较结果  38-39
    3.2.3 BR 公鸡精液、血清、泄殖腔棉拭子 3 种样品 ALVp27 抗原的直接检测与接种 DF1细胞培养后检测的比较结果  39
    3.2.4 BR 母鸡卵白、泄殖腔棉拭子、血清 3 种样品 ALVp27 抗原直接检测的比较结果  39-40
    3.2.5 同一只 BR 母鸡卵白、泄殖腔棉拭子、血清 3 种不同样品接种 DF1 细胞培养后ALVp27 抗原检测的比较结果  40-41
    3.2.6 BR 母鸡卵白、血清、泄殖腔棉拭子 3 种样品 ALVp27 抗原的直接检测与接种DF1 培养后检测的比较结果  41
4 讨论  41-45
  4.1 BR 鸡原种鸡群禽白血病的监测评估及危害评定  42-43
  4.2 鸡群中禽白血病净化所用检测材料的比较研究  43-45
结论  45-46
创新点  46-47
参考文献  47-53
致谢  53-54
个人简介  54-55
攻读硕士期间发表论文情况  55

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