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欧美杨溃疡病病菌（Lonsdalea quercina）N-5-1致病相关基因的鉴定分析

作　者: 杨莉
导　师: 贺伟
学　校: 北京林业大学
专　业: 森林保护
关键词: 欧美杨溃疡病 Lonsdalea quercina Ⅱ型分泌系统 Ⅲ型分泌系统 HrpW
分类号: S763.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


107杨(Populus×euramericana’Neva’)和中林46杨(Populus×euramericanc ’zhonglin46’)是我国北方重要的速生欧美杨品种,2006年在我国河南省首次发现了欧美杨溃疡病,这也是世界上首次报道该病害。Lonsdalea quercina被鉴定为欧美杨溃疡病的病原菌。菌株N-5-1是分离自河南濮阳自然发病杨树枝条的致病菌株。为了阐明病原菌的致病机制,以及病原菌与寄主杨树之间相互作用的过程,为病害防治提供理论依据,本研究测定了N-5-1菌株的全基因组,通过序列分析找出可能与致病性有关的22个基因,分别进行插入突变和互补,用寄主杨树品种枝条进行生物测定,筛选出与病原菌致病性有关的基因,并且利用分子生物学方法对Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system, T3SS)、Ⅱ型分泌系统(type⊕secretion system, T2SS)基因簇结构及功能,以及Ⅲ型分泌系统效应子HrpW的结构和性质做了较深入的研究。研究得出以下主要结果：(1)全基因组序列分析表明菌株N-5-1染色体上存在一套完整的T3SS系统,该系统由27个基因组成,约23kb,其中9个为高度保守的结构hrc基因,其余18个基因是调控基因或者T3SS的效应子。将T3SS中结构基因hrcV缺失突变后,生物测定结果显示其致病力与野生菌株相比显著下降,而该基因互补菌株致病性能恢复到野生菌株水平。在烟草叶片上的接种实验表明,△hrcV丧失了诱导烟草过敏性坏死反应(HR)的能力。遗传学证据表明菌株N-5-1中的T3SS是重要的致病因子之一。但当N-5-1中T3SS结构被破坏后,与野生菌株相比,突变体菌株的生长速率、生物膜形成能力以及游动性并没有受到显著影响。(2) Hrpw是N-5-1中T3SS的一个效应子,其N-端具有Harpin结构域,而C-端则具有Pel结构域。同源性分析表明HrpW具有有果胶酸裂解酶第三家族(Pectate lyase class Ⅲ PL3)4个高度保守区域,通过HrpW蛋白质理化性质以及二级结构和三级结构的预测结果显示HrpW属于PL3家族。将hrpW突变后生物测定发现,突变体致病性与野生菌株相比有一定程度的下降,但在1%极显著水平,差异是不显著的。烟草叶片接种实验结果表明,除HrpW238-459外,其余处理均能引发烟草的HR反应,由此说明N-5-1中除HrpW外还存在其他的Harpin蛋白,同时也证明了HrpW1-237具有Harpin蛋白特性,而HrpW238-459则不具有诱发HR的能力。通过氨基酸序列分析发现,HrpW238-459中有2个保守的色氨酸(tryptophan, Trp)。对这2个Trp进行定点突变、原核表达(W104A、W171M蛋白)后,与HrpW、HrpW1-237、HrpW238-459在230nm波长下检测果胶酸裂解酶(pectate lyase, Pel)酶活,结果表明HrpW1-237、 W104A不能检测出Pel活性,而HrpW、HrpW238-459的Pel活性无显著差异,W171M的酶活比HrpW下降了68.3%,由此证明了这2个Trp是处于HrpW果胶酸裂解酶的活性位点,对HrpW的活性具有重要的作用。本研究还探索了钙离子和pH对HrpW果胶酸裂解酶活性的影响,当钙离子浓度大于0.1mM的条件下,HrpW的酶活保持在一个稳定的水平,而pH8.5-9.5是HrpW的最适pH。(3)根据全基因组序列分析,发现菌株N-5-1具有由12个基因编码的完整的Ⅱ型分泌系统(type Ⅱ secretion system, T2SS)结构,并且存在Sec和Tat2种蛋白转运途径。T2SS结构基因gspE缺失突变后,生物测定发现其缺失突变体致病性显著下降,且互补菌株的致病性能恢复到野生菌株水平,本实验从遗传学角度证明了T2SS与N-5-1的致病性有直接的关系。(4)通过全基因组序列分析,搜索到菌株N-5-1中共存在3个果胶酸裂解酶(pectate lyase, Pel),利用NCBI的Blast功能比对,结果显示N-5-1中的2个pel基因(pell. Pel2)与Dickeya dadantii3937中pelA、pelD、pelE具有很高的同源性,pel3与D.zeae Ech1591菌株中pel基因的同源性达78%,而D. dadantii3937中pelA. pelD、pelE基因编码的蛋白是通过T2SS外泌。将N-5-1中3个pel基因进行缺失突变,致病性检测发现,突变体菌株致病性与野生菌株并无显著差异。在230nm波长对T2SS结构基因突变体△gspE和pel基因突变体△pell、△pel2、△pel3以及相应的互补菌株进行Pel酶活测定,结果显示当T2SS结构基因突变后,Pel酶活显著下降,而pell、pel2、pel3分别突变后突变体的Pe1酶活与野生菌株保持一致,由此推测,N-5-1菌株胞外Pel活性蛋白大多是通过T2SS系统分泌,且N-5-1菌株中单个的pel基因对菌株整体的Pel酶活以及致病性并无显著影响。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-13
1. 绪论  13-26
  1.1. 欧美杨溃疡病的症状及危害情况  13-14
  1.2 欧美杨溃疡病病菌的病原生物学研究  14
  1.3 Brenneria属重要林木病原菌及其所致病害  14-20
    1.3.1 Brenneria quercina及其所致病害  15-16
    1.3.2 Brenneria salicis及其所致病害  16-17
    1.3.3 Brenneria rubrifaciens及其所致病害  17-18
    1.3.4 Brenneria nigrifluens及其所致病害  18-19
    1.3.5 Brenneria alni及其所致病害  19
    1.3.6 Brenneria paradisiacal及其所致病害  19-20
  1.4 细菌重要的分泌系统  20-23
    1.4.1 Ⅰ型分泌系统  20-21
    1.4.2 Ⅱ型分泌系统  21
    1.4.3 Ⅲ型分泌系统  21-22
    1.4.4 Ⅳ型分泌系统  22
    1.4.5 Ⅴ型分泌系统  22
    1.4.6 Ⅵ型分泌系统  22-23
  1.5 植物病原菌分泌的酶  23-25
    1.5.1 角质酶  23
    1.5.2 果胶酶  23-24
    1.5.3 半纤维素酶  24
    1.5.4 纤维素酶  24-25
    1.5.5 蛋白酶  25
  1.6 研究目的和意义  25-26
2 Lonsdalea quercina N-5-1致病因子分析  26-45
  2.1 引言  26
  2.2 材料与方法  26-38
    2.2.1 主要仪器设备  26
    2.2.2 供试植物  26
    2.2.3 供试菌株、质粒、培养条件及引物  26-34
    2.2.4 培养基、缓冲液及药品配制  34
    2.2.5 DNA操作方法  34-37
    2.2.6 基因组测序  37
    2.2.7 致病因子分析  37
    2.2.8 插入突变载体的构建  37
    2.2.9 插入突变体的获得  37-38
    2.2.10 互补载体的构建及互补菌株的获得  38
    2.2.11 生物检测野生菌株、突变体及互补菌株的致病性  38
  2.3 结果与分析  38-43
    2.3.1 基因组测序结果  38-39
    2.3.2 致病因子分析  39-40
    2.3.3 突变体获得  40
    2.3.4 互补菌株获得  40
    2.3.5 野生菌株、突变体及互补菌株的生物检测  40-43
  2.4 小结与讨论  43-45
3 Lonsdalea quercina N-5-1中Ⅲ型分泌系统与致病性的关系  45-56
  3.1 引言  45
  3.2 材料与方法  45-48
    3.2.1 供试植物  45
    3.2.2 供试菌株、质粒、培养条件及引物  45
    3.2.3 培养基、缓冲液及药品配制  45
    3.2.4 DNA操作  45
    3.2.5 菌株N-5-1的T3SS基因簇分析  45
    3.2.6 hrcV缺失突变体的构建  45-46
    3.2.7 互补载体的构建及互补菌株的获得  46
    3.2.8 生物检测野生菌株、突变体及互补菌株的致病性  46
    3.2.9 激发HR反应能力的检测  46
    3.2.10 生长速率、生物膜及游动性检测  46-48
  3.3 结果与分析  48-54
    3.3.1 T3SS基因簇的分析  48-51
    3.3.2 Ⅲ型分泌系统缺失突变体及互补菌株的获得  51
    3.3.3 野生菌株、突变体及互补菌株致病性的生物检测  51-53
    3.3.4 HR反应能力的检测  53
    3.3.5 生长速率、生物膜及游动性检测  53-54
  3.4 小结与讨论  54-56
4 菌株N-5-1中HrpW的结构与特性  56-79
  4.1 引言  56
  4.2 材料与方法  56-64
    4.2.1 供试植物  56
    4.2.2 供试菌株、质粒、培养条件及引物  56-58
    4.2.3 培养基、缓冲液及药品配制  58-59
      4.2.3.1 SDS-PAGE电泳试剂  58-59
    4.2.4 DNA操作  59
    4.2.5 HrpW理化性质及结构预测  59-60
      4.2.5.1 HrpW理化性质分析  59-60
      4.2.5.2 HrpW高级结构预测  60
    4.2.6 hrpW缺失突变体的构建  60
    4.2.7 互补载体的构建及互补菌株的获得  60
    4.2.8 生物检测野生菌株、突变体及互补菌株的致病性  60
    4.2.9 hrpW的克隆  60-61
    4.2.10 HrpW原核表达  61
    4.2.11 HrpW N-端原核表达  61-62
    4.2.12 HrpW C-端基因的克隆  62
    4.2.13 HrpW C-端的原核表达  62
    4.2.14 HrpW C-端104位色氨酸的点突变  62
    4.2.15 W104A蛋白的原核表达  62
    4.2.16 HrpW C-端171位色氨酸的点突变  62-63
    4.2.17 W171M蛋白的原核表达  63
    4.2.18 HR反应的检测  63
    4.2.19 果胶酸裂解酶活性的定量检测  63-64
    4.2.20 Ca~(2+)浓度对果胶酸裂解酶活性的影响  64
    4.2.21 pH值对果胶酸裂解酶活性的影响  64
  4.3 结果与分析  64-77
    4.3.1 HrpW的结构分析  64-69
    4.3.2 野生菌株N-5-1、突变体及互补菌株的生物检测  69-71
    4.3.3 HrpW、HrpW~(1-237)、HrpW~(238-459)的表达  71
    4.3.4 HrpW C-端色氨酸的突变  71-72
    4.3.5 HR反应的检测  72-73
    4.3.6 果胶酸裂解酶的活性  73-75
    4.3.7 Ca~(2+)浓度对果胶酸裂解酶活性的影响  75-76
    4.3.8 pH值对果胶酸裂解酶活性的影响  76-77
  4.4 小结与讨论  77-79
5 Lonsdalea quercina N-5-1中Ⅱ型分泌系统与致病性的研究  79-90
  5.1 引言  79
  5.2 材料与方法  79-83
    5.2.1 主要仪器设备  79
    5.2.2 供试植物  79
    5.2.3 供试菌株、质粒及培养条件  79-81
    5.2.4 引物  81
    5.2.5 培养基、缓冲液及药品配制  81
    5.2.6 DNA操作方法  81
    5.2.7 菌株N-5-1的T2SS序列分析  81-82
    5.2.8 缺失突变体的构建  82-83
    5.2.9 互补载体的构建及互补菌株的获得  83
    5.2.10 生物检测野生菌株、突变体及互补菌株的致病性  83
    5.2.11 果胶酸裂解酶定性检测  83
    5.2.12 果胶酸裂解酶定量检测  83
  5.3 结果与分析  83-88
    5.3.1 Ⅱ型分泌系统丛因簇的分析  83-85
    5.3.2 pel基因同源性分析  85
    5.3.3 突变体及互补菌株的获得  85-86
    5.3.4 野生菌株、突变体及互补菌株的生物检测  86-87
    5.3.5 果胶酸裂解酶定性检测  87
    5.3.6 果胶酸裂解酶定量检测  87-88
  5.4 小结与讨论  88-90
6 结论  90-92
参考文献  92-102
附录1 hrcV基因  102-105
附录2 hrpW基因  105-107
附录3 HrpW亚细胞结构定位分析  107-108
附录4 HrpW二级结构预测  108-111
附录5 HrpW三级结构预测  111-112
个人简介  112-113
导师简介  113-114
致谢  114

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林保护学 > 森林病虫害及其防治 > 各种树的病虫害及其防治
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