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志贺氏菌Ⅲ型分泌系统效应子蛋白IpaH4.5功能研究

作　者: 王芳
导　师: 黄留玉；袁静
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 志贺氏菌 Ⅲ型分泌系统 IpaH4.5 炎症反应 NF-κB 酵母双杂交
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

志贺氏菌是一类不形成芽孢的革兰氏阴性致病菌,其致病性依赖于Ⅲ型分泌系统(Type III secretion systems, T3SS)。T3SS是一种能分泌细菌毒力因子的多蛋白复合体,是细菌致病的重要毒力武器。许多动植物致病菌利用T3SS对宿主侵袭致病。细菌的T3SS由分泌器装置(apparatus)、转位子(translocators)、效应子(effectors)、分子伴侣(chaperones)等构成。T3SS分泌的效应子具有诱导侵袭、介导吞噬逃逸、促进细菌在宿主细胞内运动和细胞间播散、干扰宿主细胞信号通路等功能。志贺氏菌在侵袭致病过程中,利用T3SS向宿主细胞释放超过25种毒力蛋白,这些毒力蛋白称为效应子(effectors),目前仅对少数效应子的功能有研究报道,大部分效应子功能未知。志贺氏菌IpaH家族蛋白由毒力大质粒和染色体上的基因共同编码,福氏志贺氏菌2a 301株的毒力大质粒上共有5个ipaH拷贝:ipaH1.4、ipaH2.5、ipaH4.5、ipaH7.8和ipaH9.8,染色体上有7个ipaH的拷贝。IpaH家族成员氨基端为6~8个富含亮氨酸蛋白(LRR)的结构域,羧基端为839个碱基构成的保守区。目前已知志贺氏菌IpaH家族蛋白由T3SS分泌,但对其功能研究并不多见。有报道IpaH7.8能够促进志贺氏菌吞噬逃逸、IpaH9.8能与哺乳动物剪接因子U2AF35结合干扰宿主的免疫反应、染色体IpaH能够抑制宿主炎症反应等,但对于毒力大质粒编码的IpaH4.5的功能,尚未见到详细的研究报道。为此,我们利用基因缺失突变技术、细胞侵袭实验、蛋白质相互作用等技术手段对IpaH4.5的功能进行了深入系统的研究。研究IpaH4.5的功能,首先需要构建ipaH4.5缺失突变株和互补株。我们利用λ-red同源重组技术构建了ipaH4.5缺失突变株,利用能够在志贺氏菌中复制且携带卡那抗性基因的pAK载体,构建了ipaH4.5缺失突变株的互补株。经PCR证实突变株中ipaH4.5缺失,互补株中ipaH4.5回复。利用RT-PCR技术对突变株和互补株中ipaH4.5的转录进行验证,结果表明突变株中的ipaH4.5没有转录活性,互补株中ipaH4.5的转录活性得到恢复,表明突变株和互补株构建成功。接下来我们对突变株、野生株和互补株的生存和侵袭相关表型进行了比较,分析ipaH4.5对志贺氏菌生长、代谢、侵袭力和毒力的影响。通过测定突变株、野生株、互补株的生长曲线和生化实验,我们发现ipaH4.5不影响志贺氏菌的生长和代谢。利用体外应激实验,我们又发现ipaH4.5也不影响志贺氏菌的对极端环境如热休克、低pH值、氧压力、渗透压等的抗力。HeLa细胞和鼠J774.A.1细胞侵袭实验结果表明,ipaH4.5缺失突变株、野生株和互补株入侵细胞的能力无明显差异。我们进一步测定了突变株、野生株和互补株感染鼠J774.A.1细胞后,培养上清中炎性因子TNF-α、IL-1β的分泌水平。结果表明,与突变株相比,野生株和互补株能够抑制鼠J774.A.1细胞分泌TNF-α和IL-1β等炎性因子,提示IpaH4.5具有抑制宿主炎症反应的功能。通过小鼠肺感染模型和豚鼠角膜实验,进一步证实IpaH4.5能够抑制宿主炎症反应,志贺氏菌缺失ipaH4.5后引起小鼠肺组织和豚鼠角膜炎症反应增强。为深入探讨IpaH4.5抑制炎症反应的机制,我们利用双荧光素酶报告基因系统检测IpaH4.5对NF-κB信号途径的影响。构建带有Flag标签和GFP标签的IpaH4.5的真核表达载体。Flag-IpaH4.5和Flag空载体分别转染293T细胞后,用相同剂量TNF-α刺激细胞,与空载体相比,IpaH4.5能够抑制NF-κB的转录活性,并且这种抑制作用随着ipaH4.5转染剂量的增加而增强,呈现明显的剂量反应关系,说明IpaH4.5能够抑制宿主细胞的NF-κB信号途径。我们随后利用激光共聚焦技术观察GFP-IpaH4.5在真核细胞中的定位,结果表明,IpaH4.5分布于细胞质和细胞核,提示IpaH4.5在细胞内通过与多种蛋白相互作用来执行功能。为阐明IpaH4.5抑制NF-κB信号途径的机制,我们利用酵母双杂交技术筛选了细胞内与IpaH4.5相互作用的蛋白。我们以ipaH4.5基因全长为诱饵,从人脾cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白质,共得到52个候选基因,通过回筛实验初步验证筛选结果的可靠性,通过测序、序列比对、功能分类,发现筛选到的蛋白基因主要涉及以下一些功能:凋亡、免疫调控、细胞黏附、转录调控等。其中包括NF-κB的p65亚基、PMSB9、HLA-C、UXT、POMP等蛋白基因,我们选择感兴趣的p65蛋白进行深入的研究。通过体外的GST pull-down实验和体内的免疫共沉淀实验(Co-IP)验证IpaH4.5与p65亚基确实存在相互作用,进一步的研究表明p65亚基上与IpaH4.5相互作用的结构域位于p65的第1~190个aa之间。随后我们又利用双荧光素酶报告基因系统验证IpaH4.5与NF-κB的p65亚基相互作用的生物学意义,证实IpaH4.5通过结合p65直接抑制NF-κB信号途径。以上研究结果表明,志贺氏菌IpaH家族蛋白成员之一—IpaH4.5与其他一些已报道的志贺氏菌T3SS效应子蛋白一样,能够干扰宿主的天然免疫、抑制宿主的炎症反应。双荧光素酶报告系统和酵母双杂交实验证明IpaH4.5通过与NF-κB的p65亚基相互作用直接抑制NF-κB信号途径,进而抑制宿主的天然免疫。有关IpaH家族蛋白功能最新的研究表明,IpaH家族蛋白成员具有非常独特的E3泛素连接酶活性,生物化学实验证据表明IpaH选择性地利用宿主中一类特殊的泛素结合酶,通过泛素化途径导致靶蛋白降解,进而在志贺氏菌对宿主的免疫抑制中起重要作用。目前还不清楚IpaH作为一种特殊的E3泛素连接酶,能够泛素化哪些宿主靶蛋白。我们通过研究筛选到与IpaH4.5相互作用的宿主蛋白,这些蛋白很可能是IpaH型E3泛素连接酶作用的底物。因此有必要进一步通过泛素化实验来证实这一猜想。通过本课题的研究,揭示了IpaH4.5抑制宿主炎症反应的分子机制,使我们对IpaH4.5的功能有了比较全面的认识,为阐明研究志贺氏菌致病的分子机制提供了重要线索,也为研制志贺氏菌疫苗提供新的思路。

全文目录

缩略语  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
前言  12-24
  1 菌痢的流行与危害  12
  2 志贺氏菌的研究概况  12-13
  3 志贺氏菌侵袭肠道粘膜的机制  13-14
  4 志贺氏菌致病的遗传学基础  14-16
  5 III型分泌系统(The Mxi-Spa T3SS)  16-22
  6 研究 T3SS 效应子与宿主细胞的相互作用是探讨细菌分子致病机制的热点  22
  7 志贺氏菌 T3SS 效应子 IpaH 家族蛋白研究进展  22-23
  8 本研究的目的意义  23
  9 技术路线  23-24
第一部分志贺氏菌 ipaH4.5 缺失突变株与互补株的构建  24-42
  1 材料与方法  25-33
  2 结果  33-39
  3 讨论  39-41
  4 小结  41-42
第二部分志贺氏菌 ?ipaH4.5 突变株与野生株毒力比较研究  42-54
  1 材料与方法  42-45
  2 结果  45-52
  3 讨论  52-53
  4 小结  53-54
第三部分 IpaH4.5对NF-κB转录活性影响及其真核细胞内定位  54-62
  1 材料与方法  54-57
  2 结果  57-60
  3 讨论  60-61
  4 小结  61-62
第四部分细胞中与 IpaH4.5 相互作用蛋白的筛选及研究  62-78
  1 材料与方法  62-68
  2 结果  68-73
  3 讨论  73-77
  4 小结  77-78
总结  78-80
参考文献  80-86
综述志贺氏菌Ⅲ型分泌系统研究进展  86-95
论著志贺氏菌福氏2a 301 株ipaH4.5 突变株的构建及生物学功能分析  95-105
个人简历  105-107
致谢  107

志贺氏菌Ⅲ型分泌系统效应子蛋白IpaH4.5功能研究

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