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黄萎病菌诱导下海岛棉全长cDNA文库构建与抗病相关基因克隆

作　者: 张书玲
导　师: 马峙英
学　校: 河北农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 棉花黄萎病 cDNA文库海岛棉抗黄萎病基因GbWRKY1 表达模式
分类号: S435.62
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

黄萎病（Verticillium wilt）是影响世界棉花生产的主要病害之一。育种实践证明，培育抗病品种是控制棉花黄萎病的经济有效途径。研究证明海岛棉Pima90-53对黄萎病具有高度抗性；对其抗黄萎病相关基因进行克隆研究不仅有利于阐明品种抗病机制，而且对棉花抗黄萎病的分子育种具有重要价值。本研究以海岛棉Pima90-53为材料，构建其在黄萎病菌诱导下的根系cDNA文库，并依据文库克隆棉花抗黄萎病相关基因。主要结果如下：1.构建了黄萎病菌诱导下的海岛棉Pima90-53根系的全长cDNA文库采用SMART技术成功构建了黄萎病菌诱导下的Pima90-53根系全长cDNA文库，该文库基础库容量为1.28×106PFU，重组率94%，扩增后文库滴度大于1010PFU·mL-1，插入片段平均长度1.1kb。经随机测序共获得45条cDNA序列，利用Blastx程序进行同源分析，4个contigs与假定抗病相关基因同源性较高；3个contigs没有注释，可能为新基因。2.利用文库筛选和RACE技术相结合，克隆了一个新的GbWRKY1基因利用构建的cDNA文库，结合RACE技术，获得了一个新WRKY基因（GbWRKY1）（GenBank No. JF831361）。GbWRKY1基因cDNA全长1971bp，包括5′端非编码区271bp，3′端非编码区230bp，含有1个可能的polyA加尾信号：AATAAT；基因开放阅读框为1470bp，编码一个由489个氨基酸构成的多肽。生物信息学分析发现GbWRKY1包括2高度保守的WRKY基本结构域和锌指结构，属于WRKY家族第Ⅰ类，与VvWRKY2、 AtWRKY4和AtWRKY3蛋白的同源性分别为62%、61%和59%；GbWRKY1属可溶性蛋白，无信号肽和跨膜结构域，包含N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、N端肉豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、依赖cAMP和cGMP蛋白激酶磷酸化位点等。GbWRKY1基因含有3个内含子，具有有保守的GT-AG剪切位点，分别为599bp、81bp、325bp。克隆得到GbWRKY1的1762bp启动子，包含植物病原诱导性启动子调控元件（RAV1AAT、Box-W1、ARE、W-box、CGTCA-motif、ERE、 TGACG-motif）与非生物胁迫应答元件（HSE、 TC-rich repeats、WRKY71OS、WBOXNTERF3、MYCATERD1）。构建了基因融合表达载体pCamE-GbWRKY1-GFP，基因枪转化洋葱内表皮细胞，结果显示转化pCamE-GbWRKY1-GFP表皮细胞的细胞核出现绿色荧光，GbWRKY1蛋白定位于细胞核。3. Northern杂交分析了GbWRKY1在黄萎病菌接种后的表达模式，揭示了基因与棉花抗黄萎病的联系；实时定量PCR分析了GbWRKY1在不同激素处理下的表达模式，为解析基因作用机制提供了依据；构建了GbWRKY1超表达与RNAi载体，获得了转基因T3拟南芥Northern杂交分析GbWRKY1表达模式发现，基因在Pima90-53的根、茎和叶组织均有表达；在受黄萎病菌、SA、MeJA和ACC的诱导后呈现不同的表达模式。在黄萎病菌诱导后，GbWRKY1基因在接种后出现持续高表达，在8h出现表达高峰，并持续高表达至接菌后12h。SA诱导后，其表达量在12h降到最低，24h基本恢复正常水平；MeJA诱导后，GbWRKY1表达量上升，在12h达到高峰，24h出现下降；ACC诱导12h，GbWRKY1表达呈现明显上升，并持续到24h。构建了GbWRKY1基因超表达和反义载体pCamE-GbWRKY1、pCamE-iGbWRKY1，通过农杆菌介导法转化拟南芥，经潮霉素筛选和PCR检测，获得了GbWRKY1过表达转基因T3拟南芥。

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