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hMAM基因启动子与增强子调控自杀基因HSV-TK靶向杀伤乳腺癌细胞

作　者: 于建刚
导　师: 林德馨
学　校: 福建医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 乳腺癌人乳腺珠蛋白重组腺病毒基因表达调控基因治疗
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 42次
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内容摘要

目的:1.构建hMAM基因启动子和增强子序列调控报告基因EGFP的重组腺病毒。2.构建hMAM基因启动子和增强子序列调控自杀基因HSV-TK的重组腺病毒。3.验证hMAM启动子和增强子调控机制的乳腺癌细胞特异性。4.探讨hMAM启动子和增强子调控自杀基因HSV-TK靶向治疗乳腺癌的方法。方法:1.根据Genebank提供的序列合成hMAM启动子和增强子(EP)DNA并构建至质粒载体pMD19-T simple。2.分别将报告基因EGFP和自杀基因HSV-TK构建于EP序列下游,获得含目的基因EP-EGFP和EP-TK的两种重组质粒pMD19-T simple-EP-EGFP和pMD19-T simple-EP-TK。3.分别将目的基因转移到腺病毒骨架粘粒载体pAxcwit2并包装获得两种重组腺病毒粘粒pAxcwit2-EP-EGFP和pAxcwit2-EP-TK。4.重组粘粒线性化并转染HEK293细胞,包装获得重组腺病毒Ad-EP-EGFP和Ad-EP-TK。5.将含重组腺病毒Ad-EP-EGFP分别感染体外培养的各细胞株:表达hMAM的乳腺癌细胞T-47D、不表达hMAM的乳腺癌细胞ZR-75-30和鼻咽癌细胞5-8F。荧光显微镜下观察报告基因GFP表达情况,验证hMAM基因启动子和增强子基因表达调控作用的乳腺癌细胞特异性。6.分别将重组腺病毒载体Ad-EP-EGFP和Ad-EP-TK感染体外培养的各细胞株:表达hMAM的乳腺癌细胞T-47D、不表达hMAM的乳腺癌细胞ZR-75-30和鼻咽癌细胞5-8F,并予前药更昔洛韦治疗。另设不予病毒感染的上述三种细胞予同样浓度前药为对照组。观察hMAM基因启动子和增强子序列调控自杀基因HSV-TK对乳腺癌细胞的靶向杀伤作用。结果:1.酶切、测序、转染等验证,两种重组腺病毒构建成功。2.荧光显微镜下显示,重组腺病毒Ad-EP-EGFP感染后,在不表达hMAM的乳腺癌细胞ZR-75-30和鼻咽癌细胞5-8F中无GFP表达,乳腺癌细胞T-47D中有表达。3.hMAM基因启动子和增强子序列调控的自杀基因HSV-TK对乳腺癌细胞T-47D具有靶向杀伤作用。用含报告基因的重组腺病毒Ad-EP-EGFP感染的T-47D细胞和无病毒感染的T-47D细胞在给于前药的情况下并未出现细胞毒性作用。不表达hMAM的细胞ZR-75-30和5-8F中,各组均无细胞毒性作用。结论:1.hMAM基因启动子和增强子具有乳腺癌细胞特异性的基因表达调控作用。2.hMAM基因启动子和增强子序列调控的HSV-TK重组腺病毒可靶向杀伤乳腺癌细胞。

全文目录

英文缩略词释义表  4-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
引言  9-12
实验材料  12-15
实验方法  15-29
实验结果  29-36
讨论  36-40
结论  40-41
参考文献  41-46
致谢  46-47
附录  47-49
综述  49-61

hMAM基因启动子与增强子调控自杀基因HSV-TK靶向杀伤乳腺癌细胞

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