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人乳腺癌细胞株Toll样受体表达及siRNA沉默Toll样受体4的实验研究

作　者: 温会燕
导　师: 申咏梅；朱雪明
学　校: 苏州大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: TLRs TLR4 siRNA MDA-MB-231 MCF-7
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:研究人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7中Toll样受体(TLRs),即TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10的表达情况及表达差异,探讨表达差异的意义。选择表达差异最显著的TLR4为靶基因,采用RNAi技术使其沉默,研究沉默前后人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中TLR4 mRNA和蛋白表达差异、细胞增殖、凋亡和细胞炎症因子分泌等生物学功能的改变,以探讨TLR4在乳腺癌发生发展中的生物学作用,为TLR4作为乳腺癌基因治疗的靶点奠定实验基础。方法:(1)培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7,采用RT-PCR和实时荧光定量PCR方法检测两细胞株TLRs mRNA表达情况,采用流式细胞技术和细胞免疫荧光技术检测TLRs蛋白表达情况,研究TLRs在两种乳腺癌细胞株的表达情况及表达差异。( 2 )根据TLR4 mRNA序列,构建真核表达载体TLR4-siRNA-pGenesil-1,共构建A、B、C三个重组质粒,分别命名为TLR4AsiRNA、TLR4BsiRNA和TLR4CsiRNA。(3)采用脂质体转染技术转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,TLR4AsiRNA、TLR4BsiRNA和TLR4CsiRNA特异性沉默TLR4基因,同时空载体pGenesil-1(简写为pGsil-1)组和未转染组作为对照。采用RT-PCR、实时荧光定量PCR技术检测转染后TLR4 mRNA变化。(4)采用流式细胞技术检测TLR4AsiRNA、TLR4BsiRNA、TLR4CsiRNA和pGsil-1转染后与未经转染的阴性对照中TLR4蛋白表达情况。(5)为了研究TLR4AsiRNA和pGsil-1转染后MDA-MB-231细胞生物学功能的改变,细胞免疫荧光技术检测TLR4蛋白表达,DAPI染色细胞凋亡情况,MTT检测细胞增殖能力的改变,流式细胞技术检测细胞因子(IL-6、IL-8)分泌的改变。结果:(1)人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7在mRNA和蛋白水平表达TLRs(TLR1～TLR10)。TLR/GAPDH mRNA相对含量比较,TLR4、TLR6、TLR8和TLR9差异最显著,在MDA-MB-231中的表达分别是MCF7的39.4±3.2倍、10.8±2.4倍、5.8±2.6倍和3.2±2.5倍(P<0.01);TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7和TLR10在两者之间无显著性差异(P>0.05)。TLRs蛋白在MDA-MB-231和MCF-7细胞之间表达差异最显著的是TLR4、TLR6、TLR7和TLR5,在MDA-MB-231中的表达分别是MCF7的6.4±1.6倍、4.1±0.9倍和3.7±0.8倍、2.8±0.4倍(P<0.01)。(2)成功构建TLR4-siRNA-pGenesil-1 : TLR4AsiRNA、TLR4BsiRNA和TLR4CsiRNA。( 3 )TLR4AsiRNA、TLR4BsiRNA和TLR4CsiRNA和pGsil-1干扰MDA-MB-231,与阴性对照相比,在mRNA水平TLR4的最大抑制率分别为75.1±3.8%、57.3±3.5%和62.3±4.3%(均P<0.01),而pGsil-1载体组无明显差异(P>0.05)。(4)流式细胞技术检测显示TLR4AsiRNA、TLR4BsiRNA和TLR4CsiRNA所对应TLR4蛋白的抑制率分别为53.7%±2.9%, 38.8%±3.7%和46.3%±3.5%,差异具有统计学意义(P<0.01),而空载体组无明显差异(P>0.05)。(5)TLR4AsiRNA沉默效果最好。(6)选择沉默效果最好的TLR4AsiRNA重组质粒转染MDA-MB-231细胞后48h,红色荧光明显减弱,TLR4蛋白表达下降。经DAPI染色,TLR4AsiRNA转染MDA-MB-231细胞后可见凋亡小体增多。MTT结果显示TLR4AsiRNA干扰后的MDA-MB-231增殖能力明显下降。流式检测TLR4AsiRNA干扰MDA-MB-231细胞后,IL-6和IL-8细胞因子分泌的抑制率分别为46.5±3.5%和48.9±2.8%,有统计学意义(P<0.05),而空载体pGsil-1无明显差异(P>0.05)。结论:人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7中表达TLRs;针对TLR4的siRNA能够显著抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖、促进MDA-MB-231细胞凋亡和减少IL-6、IL-8细胞因子的分泌。因此,TLR4可为乳腺癌的靶向基因治疗提供新依据。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
前言  10-15
实验流程  15-17
第一部分人高低转移能力乳腺癌细胞株中TLRs 表达及差异的实验研究  17-32
  1 材料  17-19
  2 方法  19-24
  3 结果  24-30
  4 讨论  30-32
第二部分 siRNA 沉默人乳腺癌细胞MDA-MB-231 Toll 样受体4 的实验研究  32-46
  1 材料  32-34
  2 方法  34-39
  3 结果  39-44
  4 讨论  44-46
结论  46-47
参考文献  47-51
综述  51-59
攻读硕士学位期间发表的学术论文  59-60
中英文对照缩略词表  60-62
致谢  62-63

人乳腺癌细胞株Toll样受体表达及siRNA沉默Toll样受体4的实验研究

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