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小鼠abcg4基因的克隆、组织表达及RNA干涉的研究

作　者: 王雪芳
导　师: 吴金美
学　校: 江苏科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: abcg4 组织表达 RT-PCR siRNA western blot 小鼠
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 8次
引　用: 1次
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内容摘要


ABCG4（ATP-binding cassette transporter G4）为一整合膜蛋白,是ABC家族转运子中的一个成员。ABC家族利用水解ATP的能量对溶质中多种生物分子进行跨膜转运,包括离子、氨基酸、磷脂、胆固醇和药物等。最近研究已经证实,ABCG4主要负责促进细胞内胆固醇流出。2008年,Uehara等应用原位杂交组化法发现,ABCG4在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）病人脑中老年斑附近的微胶质细胞中高表达,而在非AD病人中表达较低。鉴于abcg4基因及其蛋白产物在AD发生发展中所起的重要作用,本论文拟对abcg4基因做进一步的研究。根据GenBank提供的C57BL小鼠abcg4基因mRNA序列（NM138955.3）,设计引物,采用RT-PCR方法,克隆出昆明（KM）小鼠的abcg4基因,并进行测序,结果与序列NM138955.3相比有三个碱基差异（都为T-C的突变,1172、1384和1937bp处）;利用半定量RT-PCR方法测定abcg4基因在小鼠不同组织中的相对表达量,发现abcg4在脑、眼睛和脾脏中均存在表达,其中在脑和眼睛中表达较高。参照KM小鼠abcg4基因的测序结果设计以abcg4为靶基因的3个小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,应用脑定位仪向小鼠侧脑室内注射siRNA,结果发现,siRNA-003可高效抑制abcg4基因的表达,说明该小分子siRNA介导的RNA干涉具有abcg4基因沉默特异性;比较注射后不同时间的干涉效果,发现于小鼠注射48h后效果最好;siRNA对abcg4基因的抑制效果也有着剂量依赖性,在一定范围内,抑制效果随剂量增加而增强,剂量达6μg时,效果最好。当abcg4基因表达被抑制时,检测其对AD相关基因——淀粉样蛋白前体（APP）基因app和载脂蛋白E（APOE）基因ApoE,及胆固醇合成相关基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶（HMGS）基因hmgs表达的影响。通过半定量RT-PCR分析发现,app基因表达显著增高,hmgs基因表达明显下调,ApoE基因表达无明显变化。Western blot检测小鼠脑内的Thr668位点磷酸化(Phospho-Thr668)的APP蛋白表达下调。依据Feyt等（2007）的观点,APP Thr668位点的磷酸化修饰可以减少β-淀粉样蛋白（Aβ）的生成,本论文中abcg4基因表达被抑制后, APP(Phospho-Thr668)蛋白表达下调,推测最终会引起Aβ的增加。该研究通过体内siRNA干涉,为ABCG4与AD可能的关联提供了直接的证据,国内外尚未见报道。本研究通过对KM小鼠abcg4基因的克隆、测序、组织表达检测,RNA干涉及干涉后对基因app、ApoE和hmgs表达的影响分析,使我们对abcg4基因及其功能有了新的了解,为abcg4在AD发病机制中的作用提供了新的线索,为阿尔茨海默氏病的有效治疗提供了新的策略和思路。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-14
第1章 绪论  14-20
  1.1 研究背景和选题意义  14-19
    1.1.1 ABC 家族转运子  14-15
    1.1.2 ABCG 亚家族  15-17
    1.1.3 RNA 干涉  17
    1.1.4 阿尔茨海默病  17-19
  1.2 本文的主要内容  19-20
第2章 小鼠基因abcg4 的克隆与组织表达  20-40
  2.1 引言  20-21
  2.2 材料与方法  21-33
    2.2.1 实验材料  21-24
    2.2.2 实验方法  24-33
  2.3 结果与分析  33-38
    2.3.1 小鼠abcg4 基因的克隆  33-37
    2.3.2 小鼠abcg4 基因的组织表达  37-38
  2.4 讨论  38-39
  2.5 本章小结  39-40
第3章 小鼠abcg4 基因干涉的初步研究  40-47
  3.1 引言  40-41
  3.2 材料与方法  41-43
    3.2.1 实验材料  41-42
    3.2.2 实验方法  42-43
  3.3 结果与分析  43-45
    3.3.1 不同靶序列对abcg4 基因的干扰作用  43-44
    3.3.2 siRNA 注射剂量对abcg4 基因表达的影响  44
    3.3.3 注射后不同时间对abcg4 基因沉默作用的影响  44-45
  3.4 讨论  45-46
  3.5 本章小结  46-47
第4章 小鼠脑abcg4 基因被抑制后对基因app、ApoE 和hmgs 表达的影响  47-57
  4.1 前言  47-48
  4.2 材料与方法  48-53
    4.2.1 实验材料  48-50
    4.2.2 实验方法  50-53
  4.3 结果与分析  53-54
    4.3.1 半定量RT-PCR 检测基因app、ApoE 和hmgs 表达的影响  53-54
    4.3.2 免疫印迹检测APP 蛋白表达的改变  54
  4.4 讨论  54-56
  4.5 本章小结  56-57
结论  57-58
参考文献  58-65
攻读学位期间发表的学术论文  65-66
致谢  66-67
大摘要  67-72

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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