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产碱假单胞菌脂肪酶分子改造及拆分制备l-薄荷醇的研究
作 者: 陈辉
导 师: 杨立荣
学 校: 浙江大学
专 业: 生物化工
关键词: 脂肪酶 l-薄荷醇 基因文库 定点突变 化学修饰 高密度发酵 转化过程
分类号: TQ923
类 型: 博士论文
年 份: 2014年
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内容摘要
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l-薄荷醇是一种重要的手性化合物,具有特别的薄荷香气和强烈的清凉作用,气味新鲜轻快,同时它还具有兴奋镇痛、杀菌止痒、促渗透、助消化等功效,因此具有很高的工业和医药应用价值。由于天然提取的l-薄荷醇的品质易受各种因素的影响且近年来市场需求越来越大,天然来源的l-薄荷醇已不再满足日益增长的需求。采用生物催化的方法获得l-薄荷醇正逐渐成为研究的热点。本文在前期筛选得到一株产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes CGMCC4405),能够产生对四对外消旋薄荷醇丙酸酯进行选择性水解的脂肪酶(PaL)。在此基础上,通过构建基因文库对PaL的基因进行了克隆和异源表达。对重组PaL进行了表达纯化测定其精确分子量为58094.3Da。通过肽指纹图谱验证了由DNA序列推测得到的氨基酸序列的准确性。远紫外区圆二色谱结果表明PaL含有26.8%的α螺旋,34.2%的β折叠,14.2%的转角和24.7%无规卷曲。PaL拆分四对外消旋薄荷醇丙酸酯具有较好的对映体选择性,其E>200。但其非对映体选择性有待于进一步提高。摇瓶发酵脂肪酶PaL的酶活为4625U/L。最适温度为35℃,最适pH为9.0。在pH6.5-10.0之间都有较好的稳定性,但热稳定性相对较差。针对PaL具有非常好的对映体选择性这一问题,我们研究了PaL的对映体识别机理。通过对酶-底物复合物结构进行分析发现：当脂肪酶PaL与d-薄荷醇丙酸酯结合时,位于R构型的手性中心C2上的异丙基的取向朝向催化组氨酸His271。异丙基的空间位阻迫使催化组氨酸His271的咪唑环偏转了约30°。这一偏转直接导致了Hε(His271)与O(alcohol)之间距离由2.2A拉大到3.7A,进而使得这两个原子之间的必须氢键无法形成。从而最终导致了d-薄荷醇丙酸酯与脂肪酶PaL形成的酶-底物复合物不够稳定,与l-薄荷醇丙酸酯相比无法正常水解。这可能是脂肪酶PaL具有很好对映体选择性的根本结构原因通过底物分子共价对接技术研究了l-薄荷醇丙酸酯和非目标底物与PaL的结合方式,并以此为指导构建了突变蛋白V180L/A272F。突变型PaL催化的水解产物中l-薄荷醇对l-新薄荷醇的非对映体比率由野生型的6.6：1提高到30.7：1。而对d-新异薄荷醇的非对映体比率则由12.0：1提高到25.5：1。分子动力学模拟表明定点突变在特定位置引入了较大的空间位阻效应,限制了底物手性中心上所连基团的空间取向,同时突变位点附近区域增大的结构刚性巩固了由空间位阻引起的限制作用从而最终强化了PaL对不同构型底物的分子识别,提高了非对映体选择性。为进一步提高非对映体选择性,我们采用了定点突变结合体外化学修饰的方法。首先构建突变体A272C,引入了化学修饰的特异性靶点。然后使用DTNB对半胱氨酸进行特异性修饰,获得了A272C-DTNB修饰脂肪酶。MALDI-TOF mass验证了DTNB的有效修饰。远紫外区和近紫外区圆二色谱结果表明DTNB的修饰没有引起PaL二级结构和三级结构的明显变化。综合拆分实验结果和分子动力学模拟结果发现：由DTNB的化学修饰引入了较大的空间位阻相应和降低了PaL修饰位点附近区域结构柔性,使得脂肪酶对非目标底物的Km值有了较大幅度的提高。这种区域结构柔性与非目标底物Km值的相关性可以解释为由DTNB的化学修饰所引起的增大的局部空间位阻效应和降低的区域结构柔性阻碍了非目标底物的诱导契合过程,从而降低了A272C-DTNB修饰脂肪酶对非目标底物的亲和性,提高了非目标底物的Km值,从而最终导致了化学修饰脂肪酶的非对映体选择性的进一步提高。为实现PaL的高效制备,我们研究了重组E.coli的高密度发酵技术。分批发酵阶段研究确定了葡萄糖对细胞干重的得率系数Yx/s=0.7,同时研究确定了20℃为最有利于重组脂肪酶诱导表达的温度。在补料发酵阶段,我们发现控制比生长速率μ=0.21h-1时对细胞的生长和积累最为有利。此时,乙酸浓度可以控制在较低水平,同时葡萄糖也不存在积累现象。所得最大细胞干重在70g/L左右。诱导时机的研究结果表明第15小时开始诱导,IPTG加入量为20μmol/g干菌体最为合适。重组脂肪酶发酵游离酶活为200000U/L左右。全细胞酶活为20000U/L。SDS-PAGE电泳结果表明重组脂肪酶以可溶性表达为主,基本没有包涵体形成。在前面实现高密度发酵的基础上,使用重组E.coli全细胞对四对外消旋薄荷醇进行拆分。研究确定了转化温度为30℃。随后研究了重组E.coli全细胞的底物和产物抑制情况。对对拆分反应有显著影响的催化剂载量、底物浓度和助溶剂加量进行了优化。确定最优催化剂载量为2U/mL酶活所对应的全细胞量,底物浓度为1000mM,添加5%助溶剂加量。在该条件下拆分四对外消旋薄荷醇制备l-薄荷醇的时空产率为1.54gL-1h-1。通过精馏得到的产物l-薄荷醇dep最高为87.4%,纯度为90.35%。实际总收率可达88.42%。
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全文目录
致谢 5-6
摘要 6-9
Abstract 9-18
第一章 绪论 18-39
1.1 手性化学品与生物拆分 18-20
1.1.1 手性与手性化学品 18-19
1.1.2 生物拆分的原理及其特点 19-20
1.2 生物催化及其发展历程 20-21
1.2.1 第一次技术浪潮 20
1.2.2 第二次技术浪潮 20-21
1.2.3 第三次技术浪潮 21
1.3 生物催化剂 21-22
1.3.1 生物催化剂的获得 21-22
1.3.2 微生物来源生物催化剂的获得方法 22
1.4 脂肪酶及其研究背景 22-25
1.4.1 脂肪酶简介及其分类 22-23
1.4.2 脂肪酶的结构特点 23-24
1.4.3 脂肪酶的催化机理 24-25
1.5 脂肪酶的手性选择性及其研究进展 25-31
1.5.1 脂肪酶的选择性 25-26
1.5.2 脂肪酶的立体选择性的结构基础 26-28
1.5.3 提高脂肪酶的立体选择性的方法 28-31
1.5.3.1 反应条件的影响 28-29
1.5.3.2 脂肪酶分子固定化提高立体选择性 29
1.5.3.3 加入冻干助剂提高立体选择性 29
1.5.3.4 脂肪酶分子结构改造提高选择性 29-31
1.6 l-薄荷醇制备的方法以及进展 31-36
1.6.1 薄荷醇简介 31-33
1.6.2 l-薄荷醇化学制备 33-34
1.6.2.1 由旋光性天然化合物合成 33
1.6.2.2 由无旋光性的化合物或石油化学品进行合成 33-34
1.6.3 l-薄荷醇的生物催化制备 34-36
1.7 本课题的研究思路与主要内容 36-39
1.7.1 研究思路 36-37
1.7.2 研究内容 37-39
第二章 脂肪酶PaL基因克隆、表达与酶学性质表征 39-54
2.1 前言 39
2.2 材料和方法 39-42
2.2.1 质粒与菌种 39
2.2.2 实验仪器 39-40
2.2.3 主要试剂 40
2.2.4 试剂配置 40-41
2.2.5 培养基 41-42
2.3 实验方法 42-46
2.3.1 脂肪酶基因的表达及重组脂肪酶PaL纯化 42-44
2.3.1.1 脂肪酶PaL基因导出 42-43
2.3.1.2 表达载体的构建 43
2.3.1.3 IPTG诱导表达 43
2.3.1.4 脂肪酶的纯化与精确分子量测定 43-44
2.3.2 重组脂肪酶PaL结构表征 44
2.3.2.1 脂肪酶PaL肽指纹图谱表征 44
2.3.2.2 脂肪酶PaL圆二色谱(CD)表征 44
2.3.3 重组脂肪酶PaL基本酶学性质研究 44-46
2.3.3.1 PaL酶活测定方法 44-45
2.3.3.2 酶的最适温度 45
2.3.3.3 酶的温度稳定性 45
2.3.3.4 酶的最适pH 45
2.3.3.5 酶的酸碱稳定性 45
2.3.3.6 脂肪酶PaL反应动力学研究 45-46
2.3.3.7 脂肪酶PaL拆分外消旋薄荷醇丙酸酯的对映体选择性及非对映体选择性 46
2.4 结果与讨论 46-53
2.4.1 前期基因文库构建结果[75] 46-47
2.4.2 脂肪酶基因的表达及重组脂肪酶PaL纯化 47-48
2.4.2.1 脂肪酶PaL的诱导表达 47
2.4.2.2 脂肪酶的纯化 47-48
2.4.3 重组脂肪酶PaL结构表征 48-50
2.4.3.1 脂肪酶PaL肽指纹图谱表征 48-50
2.4.3.2 脂肪酶PaL圆二色谱(CD)表征 50
2.4.4 重组脂肪酶PaL基本酶学性质研究 50-53
2.4.4.1 脂肪酶PaL的最适温度和温度稳定性 50-51
2.4.4.2 脂肪酶PaL的最适pH和pH稳定性 51-52
2.4.4.3 脂肪酶PaL反应动力学研究 52
2.4.4.4 脂肪酶PaL拆分外消旋薄荷醇丙酸酯的对映体选择性及非对映体选择性 52-53
2.5 本章小结 53-54
第三章 脂肪酶PaL的分子模建与对映体识别机理研究 54-67
3.1 前言 54-55
3.2 实验方法 55-60
3.2.1 脂肪酶PaL的分子模建 55-56
3.2.2 脂肪酶PaL模建结果验证 56-57
3.2.3 对接受体蛋白准备 57
3.2.4 底物配体的准备 57
3.2.5 配体构象分析 57-58
3.2.6 配体与脂肪酶PaL共价分子对接得到酶-底物复合物构象 58
3.2.7 建立小分子配体的电荷信息以及力场参数 58
3.2.8 创建非标准氨基酸Ser133力场参数 58
3.2.9 结构初始化 58-59
3.2.10 MD运算 59
3.2.11 定点突变调节脂肪酶PaL的对映体选择性 59-60
3.3 结果与讨论 60-66
3.3.1 脂肪酶PaL的分子模建 60-61
3.3.2 模型评价 61
3.3.3 定点突变验证模型准确性 61
3.3.4 底物分子共价对接及分子动力学模拟 61-66
3.3.4.1 酶-底物复合物模拟过程中的骨架振动 61-62
3.3.4.2 酶-底物复合物必须氢键的形成分析 62-64
3.3.4.3 酶-底物复合物区域柔性分析 64
3.3.4.4 催化残基His271的二面角变化 64-65
3.3.4.5 定点突变调节脂肪酶PaL的对映体选择性 65-66
3.4 本章小结 66-67
第四章 脂肪酶PaL非对映体分子识别机理及理性设计 67-82
4.1 前言 67-68
4.2 材料和方法 68-69
4.2.1 质粒与菌种 68
4.2.2 实验仪器 68
4.2.3 主要试剂 68-69
4.2.4 试剂配置 69
4.2.5 培养基 69
4.3 实验方法 69-72
4.3.1 可反应底物与脂肪酶PaL的分子对接 69-70
4.3.1.1 蛋白的准备 69
4.3.1.2 配体的准备 69
4.3.1.3 配体构象分析 69-70
4.3.1.4 配体与脂肪酶PaL共价分子对接 70
4.3.2 突变方法 70-71
4.3.3 脂肪酶PaL各突变体诱导、纯化 71
4.3.4 脂肪酶PaL拆分外消旋薄荷醇丙酸酯的非对映体选择性 71
4.3.5 底物转化率和脂肪酶PaL及其突变体非对映体选择性的测定 71
4.3.6 野生型及突变型脂肪酶V180L/A272F反应动力学参数测定 71-72
4.3.7 脂肪酶PaL及其突变体的分子动力学(MD)模拟 72
4.3.7.1 结构初始化 72
4.3.7.2 MD运算 72
4.4 结果与讨论 72-79
4.4.1 底物分子共价对接及突变位点设计 72-75
4.4.2 突变脂肪酶非对映体选择性及底物分子构型识别特异性测定 75-76
4.4.3 野生型及体外修饰脂肪酶反应动力学参数测定 76-77
4.4.4 分子动力学模拟及蛋白质区域柔性对非对映体选择性的影响 77-79
4.5 本章小结 79-82
第五章 定点突变结合体外化学修饰提高脂肪酶PaL非对映体选择性 82-96
5.1 前言 82-83
5.2 材料和方法 83-84
5.2.1 质粒与菌种 83
5.2.2 实验仪器 83
5.2.3 主要试剂 83-84
5.2.4 试剂配置 84
5.2.4.1 DTNB修饰液配置 84
5.2.4.2 其他试剂 84
5.2.5 培养基 84
5.3 实验方法 84-87
5.3.1 定点突变构建突变体A272C 84
5.3.2 突变型脂肪酶A272C的诱导、纯化 84
5.3.3 突变型脂肪酶A272C的体外化学修饰与纯化 84-85
5.3.4 修饰蛋白的质谱表征 85
5.3.5 修饰蛋白的圆二色谱表征 85
5.3.6 野生型、突变型及体外修饰脂肪酶拆分外消旋薄荷醇丙酸酯的非对映体选择性 85
5.3.7 野生型及体外修饰脂肪酶反应动力学参数测定 85-86
5.3.8 野生型、突变型及体外修饰脂肪酶PaL的分子动力学模拟 86-87
5.3.8.1 蛋白文件、配体文件准备及底物分子共价对接 86
5.3.8.2 野生型、突变型及体外修饰脂肪酶与底物复合物结构初始化 86
5.3.8.3 MD运算 86-87
5.4 结果与讨论 87-95
5.4.1 修饰蛋白的质谱表征 87-88
5.4.2 修饰蛋白的圆二色谱表征 88-89
5.4.3 野生型脂肪酶PaL及其突变体A272C以及DTNB修饰脂肪酶的非对映体选择性表征 89-90
5.4.4 野生型及体外修饰脂肪酶反应动力学参数测定 90-91
5.4.5 野生型、突变型及体外修饰脂肪酶PaL的分子动力学模拟 91-95
5.4.5.1 空间位阻效应的影响 91-93
5.4.5.2 结构柔性的影响 93-95
5.5 本章小结 95-96
第六章 重组E.coli高密度发酵制备脂肪酶PaL 96-110
6.1 前言 96
6.2 材料和方法 96-99
6.2.1 质粒与菌种 96-97
6.2.2 实验仪器 97
6.2.3 培养基 97
6.2.4 培养方法 97-98
6.2.4.1 摇瓶种子培养 97
6.2.4.2 分批发酵培养 97
6.2.4.3 补料分批发酵培养 97-98
6.2.5 分析方法 98-99
6.2.5.1 菌体干重的测定 98-99
6.2.5.2 酶活测定方法 99
6.2.5.3 葡萄糖浓度测定 99
6.2.5.4 乙酸浓度测定 99
6.3 实验结果 99-108
6.3.1 分批发酵 99-101
6.3.1.1 细胞干重对葡萄糖得率系数测定 99-100
6.3.1.2 诱导温度确定 100-101
6.3.2 补料分批发酵 101-108
6.3.2.1 控制不同比生长速率对发酵菌体密度的影响 101-104
6.3.2.2 不同诱导时机对发酵产酶的影响 104-107
6.3.2.3 不同诱导剂(IPTG)加量对发酵产酶的影响 107-108
6.4 本章小结 108-110
第七章 重组E.coil全细胞水解拆分外消旋薄荷醇并酸酯制备Ⅰ-薄荷醇的研究 110-126
7.1 前言 110
7.2 材料和方法 110-114
7.2.1 转化所用全细胞 110
7.2.2 主要试剂 110
7.2.3 实验仪器 110-111
7.2.4 重组全细胞温度及温度稳定性测定 111
7.2.5 重组全细胞在不同温度条件下的半衰期及产物的光学纯度 111
7.2.6 全细胞用量实验 111
7.2.7 最适底物浓度测定 111-112
7.2.8 最适助溶剂用量测定 112
7.2.9 重组全细胞的产物抑制与产物分配系数测定 112
7.2.10 重组全细胞催化反应的批次反应稳定性 112-113
7.2.11 产物l-薄荷醇与底物的分离 113
7.2.12 产物l-薄荷醇鉴定 113
7.2.13 产物l-薄荷醇精馏制备 113-114
7.3 实验结果 114-124
7.3.1 转化过程温度的选择 114-115
7.3.2 转化过程温度的选择 115-116
7.3.3 全细胞用量的确定 116-117
7.3.4 底物浓度的确定 117
7.3.5 最适助溶剂浓度的确定 117-119
7.3.6 产物浓度对全细胞催化不对称水解反应的影响及产物分配系数测定 119
7.3.7 重组全细胞反应的批次反应稳定性 119-120
7.3.8 产物l-薄荷醇的分离提取及鉴定 120-122
7.3.8.1 l-薄荷醇的分离提取与纯化 120-121
7.3.8.2 所得l-薄荷醇的结构鉴定 121-122
7.3.9 产物l-薄荷醇精馏制备及物料衡算 122-124
7.4 总结 124-126
第八章 总结与展望 126-130
8.1 总结 126-128
8.2 展望 128-130
参考文献 130-144
附录 144-157
作者简介及博士期间的研究成果 157
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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制高级醇及多元醇
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