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硫酸多粘菌素B菌种选育与发酵工艺的研究

作　者: 田东
导　师: 袁其朋
学　校: 北京化工大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 硫酸多粘菌素B 发酵 多粘类芽孢杆菌 菌种诱变 常压低温等离子体诱变
分类号: TQ927
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


硫酸多粘菌素B (Polymyxin B Sulfate)是一种由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)产生的氨基酸和脂肪组成的碱性琐环状多肽抗生素,它对各种革兰阴性菌引发的疾病有显著的疗效。多年来,多粘菌素B一直依赖于进口,为改变该现状,本文对多粘菌素B生产菌的诱变育种及发酵生产进行了系统的研究,并取得了良好效果。通过对培养基的优化,确定了可溶性淀粉和葡萄糖作为复合碳源时以及(NH4)2SO4和玉米浆作为复合氮源时,多粘菌素B产量最高；同时我们还考察了NaCl、KH2PO4、MgSO4以及生长因子和前体对菌体生长和多粘菌素B产量的影响。然后对产量影响较大的四个因素即可溶性淀粉、(NH4)2SO4、玉米浆和MgSO4进行了响应面实验分析,采用Box-Behnken实验设计,对发酵培养基进行优化,最终确定发酵培养基配方为：可溶性淀粉33.3 g/L,葡萄糖15 g/L,玉米浆31.8ml/L,(HN4)2SO4 8.7g/L,NaCl 0.6 g/L,KH2PO4 0.8g/L,MgSO4 0.2g/L,CaCO3 10g/L,pH6.8。通过发酵验证,多粘菌素B的产量由596mg/L提高到804.82mg/L,比优化前提高了35.1%。同时,又对多粘菌素B生产菌的发酵条件进行了优化,分别考察了种龄、初始pH值、接种量、温度、发酵时间、摇床转速等对多粘菌素B产量的影响,最终选择了对其产量影响较大的三个因素即初始pH值、发酵温度和发酵时间,采用Box-Behnken实验设计进行响应面分析优化,确定了最佳发酵条件为：初始pH值6.72,温度30.64℃,发酵时间37.72h。在此条件下进行发酵验证,多粘菌素B的产量可由804.82 mg/L提高到915.48mg/L,比优化前提高了13.7%。为了进一步提高产量,本文运用常压低温等离子体进行诱变以及琼脂块扩散法进行筛选等手段进行菌种选育,从2583株诱变后的菌株中获得了一株高产且遗传性能稳定的优良菌株。通过初始培养基进行发酵生产,多粘菌素B的产量可由596mg/L提高到1159mg/L,比出发菌株提高了94.5%。为了验证高产菌株在优化后的培养基和培养条件下多粘菌素B产量可以达到的最大值,我们将筛选到的高产菌株接入到优化后的培养基中进行发酵,最终多粘菌素B的平均产量可由596mg/L提高到1341 mg/L,比出发菌株提高了125%

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章 绪论  12-30
  1.1 概述  12
  1.2 多粘菌素B物理化学性质  12-13
  1.3 多粘菌素的发展过程  13-14
  1.4 多粘菌素B药理学的研究进展  14-16
    1.4.1 抗茵机理及活性  14
    1.4.2 药物代谢动力学  14
    1.4.3 药物效应学  14-15
    1.4.4 毒理学  15
    1.4.5 多粘菌素B对大肠杆菌的抗生素后效应  15-16
  1.5 多粘菌素B的研究现状  16-17
    1.5.1 多粘菌素B的生产方法  16
    1.5.2 多粘菌素B的合成机制  16-17
    1.5.3 多粘菌素B的市场需求  17
  1.6 多粘菌素B发酵工艺的研究  17-26
    1.6.1 菌种的诱变及选育  18-23
    1.6.2 培养基的优化  23-24
    1.6.3 发酵条件  24
    1.6.4 发酵液的预处理  24-25
    1.6.5 多粘菌素B的浓缩与纯化  25-26
  1.7 多粘菌素B的检测方法  26-27
    1.7.1 管碟法  26
    1.7.2 HPLC检测方法  26-27
  1.8 响应面法  27
  1.9 本文研究的意义、目的和内容  27-30
第二章 材料与方法  30-38
  2.1 菌种和培养基  30
    2.1.1 出发菌株  30
    2.1.2 培养基组成  30
  2.2 实验药品与仪器设备  30-31
  2.3 实验方法  31-38
    2.3.1 培养条件  31
    2.3.2 分析测定方法  31-38
第三章 多粘菌素B发酵生产中培养基的优化  38-64
  3.1 前言  38
  3.2 材料与方法  38-39
    3.2.1 多粘菌素B生产菌  38
    3.2.2 培养基的组成  38
    3.2.3 响应面试验设计  38-39
  3.3 结果与讨论  39-61
    3.3.1 培养基的单因素实验  39-52
    3.3.2 培养基的Box-Behnken实验设计  52-61
  3.4 本章小结  61-64
第四章 多粘菌素B发酵生产中发酵条件的优化  64-80
  4.1 引言  64
  4.2 材料与方法  64-65
    4.2.1 多粘菌素B生产菌  64
    4.2.2 培养基的组成  64
    4.2.3 响应面试验设计  64-65
  4.3 结果与讨论  65-77
    4.3.1 发酵条件的单因素实验  65-70
    4.3.2 发酵条件的Box-Behnken实验设计  70-77
  4.4 本章小结  77-80
第五章 多粘菌素B生产菌的选育  80-92
  5.1 引言  80-81
  5.2 材料与方法  81-83
    5.2.1 初始菌株  81
    5.2.2 培养基  81
    5.2.3 实验设备  81
    5.2.4 实验方法  81-83
  5.3 结果与讨论  83-90
    5.3.1 等离子体诱变剂量的考察  83-84
    5.3.2 筛选菌株  84-86
    5.3.3 诱变株的遗传稳定性实验  86-87
    5.3.4 二次选育  87-90
    5.3.5 高产菌株的发酵验证  90
  5.4 本章小结  90-92
第六章 结论与展望  92-96
  6.1 实验结论  92-94
  6.2 展望  94-96
参考文献  96-100
附录  100-102
  附录1 主要仪器设备及用途  100-101
  附录2 主要试剂药品  101-102
致谢  102-103
研究成果及发表的学术论文  103-105
作者和导师简介  105

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制抗菌素
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