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新荧光衍生试剂及其在羧基化合物的分析中的应用研究

作　者: 陈浩
导　师: 张华山
学　校: 武汉大学
专　业: 分析化学
关键词: 高效液相色谱毛细管电泳荧光衍生羧基化合物哌嗪试剂脂肪酸植物激素 1,3,5,7-四甲基-8-丙酰肼-二氟化硼-二毗咯甲烷(TMBB-P)
分类号: O657
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

羧基化合物是一类以碳链为基础骨架,以羧基为官能团的化合物,常见的羧基化合物在生命体内均有分布,大多数的含羧基类的物质既是生命活动中重要生化反应的底物,又是重要的代谢产物,它们在生物体内的含量高低跟生命活动的阶段和生命系统功能运转是否正常息息相关；此外伴随着人类对自然的改造,羧基化合物也是人类活动造成的常见环境污染物,因此定量检测羧基化合物一直是被分析工作者密切关注的领域。高效液相色谱荧光检测法和毛细管电泳激光诱导荧光法能同时检测多种羧基化合物,被认为是检测羧基化合物的有效手段,采用荧光检测器的荧光检测方法可以达到很高灵敏度,但是荧光方法都非常依赖于荧光衍生试剂的性能,因此,发展性能更加优秀的荧光衍生试剂是色谱和电泳领域的一个重要研究方向。本论文的研究内容核心是羧基化合物的检测以及为此目的的新试剂和新分析方法,具体的研究内容如下：1.设计并合成以BODIPY为荧光团,以丁酰哌嗪为反应基团的新型有机羧酸类荧光衍生试剂1,3,5,7-四甲基-8-丁酰哌嗪-二氟化硼-二吡咯甲烷(TMBB-P),并对TMBB-P及其羧酸衍生物的荧光性质进行了较系统地研究,讨论了环境介质中各种因素对试剂及羧基衍生物荧光性质的影响。实验表明,TMBB-P及其衍生物的最大吸收和最大发射波长分别为493nm和506nm,衍生物的荧光量子率在乙腈中高达0.953；试剂及其衍生物的荧光对pH值不敏感和对光稳定性好,衍生物的荧光强度在大范围pH值改变下基本保持不变,在有机溶剂和水溶液中荧光强度均优于荧光素类衍生试剂,预示了此试剂能同时具有应用于高效液相色谱和毛细管电泳检测羧酸类物质的能力。2.以新合成的TMBB-P为柱前衍生试剂,对衍生条件和分离条件进行了优化,建立了高效液相色谱分离荧光检测脂肪酸的新方法。研究表明,以EDC为缩合剂,吡啶为催化剂,在55℃下,45min内衍生试剂与丙酸,丁酸,戊酸,已酸,庚酸,壬酸,癸酸,月桂酸,肉豆寇酸,棕榈酸,硬脂酸,油酸等十二种脂肪酸即可反应完全,衍生物非常稳定。流动相为甲醇、pH6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液、四氢呋喃和纯水按比例混合,在C8柱上采用梯度洗脱,在42min内完成对脂肪酸衍生物的色谱分离。定量测定浓度线性范围为5-100nM,检测限为0.3-1.2nM,方法应用于对健康小鼠和脂多糖诱导的急性炎症肝损伤的小鼠的肝脏中的脂肪酸进行定量分析,其回收率为93.4-106.4%,实验结果显示有肝损伤的小鼠的肝脏中的脂肪酸有显著上升。3.多不饱和脂肪酸在人类生理活动中有着特殊的贡献和重要的价值,鉴于实际应用中常有单独检测此类物质的需求,建立了以TMBB-P为衍生试剂,检测花生四烯酸(ARA)和二十二碳六烯酸(DHA)的高效液相色谱方法,对影响衍生和分离的各种参数作了优化。DHA和ARA的衍生产物在40min内完全分离,检测限分别为0.6nM和为1.8nM,该方法用于食用油中不饱和脂肪酸DHA和ARA的测定,实验结果显示花生油的两种不饱和脂肪酸的含量要高于菜籽油,两种食用油均未达到与中国饮食习惯相近的日本食品组织推荐的ARA:DHA=1:4的比例,需要额外摄入DHA。4.近年,植物激素的检测备受重视,我们采用TMBB-P作为柱前衍生试剂,以EDC作为缩合剂,吡啶作为催化剂,50℃衍生60min,试剂与吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、吲哚丁酸(IBA)、茉莉酸(JA)、萘乙酸(NAA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)等六种羧基化合物类植物激素发生衍生反应并达到平衡。用高效液相色谱分离荧光检测衍生物,在C8色谱柱上,优化分离条件为：以甲醇：水：缓冲溶液(pH6.5的H3Cit-Na2HPO4):四氢呋喃=60:22.5:10:7.5(v/v/v/v)溶液为流动相等度洗脱,建立了用高效液相色谱分离荧光检测的新方法,植物激素衍生物在25min内得到很好的分离,浓度线性范围1.0-100nM,检测限为0.6-1.6nM,回收率在96.0%-108.4%之间。方法用于检测黄瓜和番茄中的植物激素含量,JA、IAA和NAA三种内源性植物激素均被检测到。实验结果表明,该方法选择性好,样品经过简单的前处理的粗提物可以直接衍生,灵敏度令人满意。5.将柱前荧光衍生试剂TMBB-P应用于毛细管电泳分离激光诱导荧光检测羧基化合物类植物激素,建立了测定植物样品中七种植物激素赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、吲哚丁酸(IBA)、茉莉酸(JA)、萘乙酸(NAA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的新分析方法。衍生试剂与七种植物激素,50℃下衍生60min即可反应完全,电泳缓冲液以pH9.0的40mM硼酸-硼砂体系为缓冲溶液,25mM的SDS为表面活性剂,20%的乙腈作为有机添加剂,分离电压22.5kV。衍生物在20min左右得到分离,检测限为0.3-1.2nM,样品中的回收率在93-106%之间。该方法用于检测月季不同部位的植物激素,虽然由于TMBB-P试剂有一定疏水性,此方法与6-O-乙酰哌嗪荧光素(APF)方法相比并没达到TMBB-P试剂和APF试剂相比的荧光增强幅度,但检出限仍有了大幅的提高,结果令人满意。6.以6-O-乙酰哌嗪荧光素(APF)作为柱前衍生试剂,以常见的七种植物激素为分析对象,建立了柱前衍生毛细管电泳分离-激光诱导荧光检测植物激素的新分析方法。详细研究了APF与植物激素的衍生条件和衍生物的CE分离条件及在电泳中的分离行为,实验表明,在优化浓度的1-乙基-3-(3-二乙氨基丙基)碳二亚胺(EDC)存在时,植物激素在60℃下衍生60min即可反应完全,衍生物用含有15mM SDS,12%(v/v)乙醇,25mM pH9.0的硼酸-硼砂盐的混合溶液作为电泳缓冲溶液,七种羧基衍生物及衍生试剂可在20min内完全分离,检测限最低达到1.6nM,灵敏度与采用了固相微萃取柱富集的液相色谱串联质谱联用分析方法相仿。此方法用于检测处于不同成熟阶段的香蕉的粗提物中的植物激素,回收率在90.7-106.1%之间,较之已有的各类植物激素测定方法,本方法具有样品前处理简便、分离时间短、灵敏度高,成本低廉等特点。

全文目录

摘要  10-13
Abstract  13-16
第—章绪论  16-53
  1.1 羧基化合物的基本性质及生物功能概述  16-19
  1.2 羧基化合物的检测方法  19-26
    1.2.1 酶检测法  20
    1.2.2 紫外-可见分光光度法  20-21
    1.2.3 电化学分析法  21-22
    1.2.4 免疫分析法  22-23
    1.2.5 气相色谱法  23-24
    1.2.6 高效液相色谱法(HPLC)  24-25
    1.2.7 毛细管电泳法(CE)  25-26
  1.3 羧基化合物的衍生试剂和分子荧光探针  26-34
    1.3.1 溴甲基类  27-29
    1.3.2 重氮甲烷类试剂  29-30
    1.3.3 肼基类试剂  30-32
    1.3.4 醇类试剂  32
    1.3.5 胺类试剂  32-34
    1.3.6 磺酸钠类试剂  34
  1.4 论文选题思想  34-36
  参考文献  36-53
第二章 TMBB-P的设计、合成与表征、其荧光性质及其衍生物荧光性质的研究  53-68
  2.1 引言  53-56
  2.2 实验部分  56-58
    2.2.1 仪器与试剂  56-57
    2.2.2 戊二酸乙酯酰氯的制备  57
    2.2.3 2,4-二甲基吡咯的合成  57
    2.2.4 1,3,5,7-四甲基-8-丁酰哌嗪二氟化硼二吡咯甲烷的合成  57-58
  2.3 TMBB-P及其衍生产物荧光性质研究  58-59
    2.3.1 荧光试剂及其衍生产物的制备  58-59
    2.3.2 荧光光谱的测定  59
    2.3.3 荧光量子产率的测定  59
    2.3.4 荧光试剂的光稳定性测定  59
  2.4 结果与讨论  59-65
    2.4.1 TMBB-P及其衍生产物的荧光光谱性质  59-60
    2.4.2 TMBB-P及其衍生产物的荧光量子产率  60-61
    2.4.3 TMBB-P试剂及其衍生产物的荧光光稳定性  61-62
    2.4.4 pH值对TMBB-P试剂及其衍生产物荧光强度的影响  62-63
    2.4.5 有机溶剂对TMBB-P试剂及其衍生产物荧光性质的影响  63-65
  参考文献  65-68
第三章 1,3,5,7-四甲基-8-丁酰哌嗪-二氟化硼-二吡咯甲烷柱前衍生HPLC分离荧光检测脂多糖诱导肝损伤小鼠血清中的脂肪酸  68-82
  3.1 引言  68-69
  3.2 实验部分  69-71
    3.2.1 实验仪器  69-70
    3.2.2 实验试剂  70
    3.2.3 实验方法  70-71
  3.3 结果与讨论  71-76
    3.3.1 色谱分离条件的优化  71
    3.3.2 共存物质干扰与排除  71-72
    3.3.3 衍生条件的优化  72-74
    3.3.4 稳定性实验  74-75
    3.3.5 线性回归分析及检测限  75
    3.3.6 样品分析  75-76
  3.4 与常用羧基化合物衍生试剂比较  76-78
  3.5 结论  78-79
  参考文献  79-82
第四章 1,3,5,7-四甲基-8-丁酰哌嗪-二氟化硼-二吡咯甲烷柱前衍生高效液相色谱分离检测食用油中的多不饱和脂肪酸  82-91
  4.1 引言  82-83
  4.2 实验部分  83-84
    4.2.1 实验仪器  83
    4.2.2 试剂  83-84
    4.2.3 实验方法  84
  4.3 结果与讨论  84-88
    4.3.1 色谱分离条件优化  84-85
    4.3.2 衍生条件的优化  85-86
    4.3.3 共存物的影响和干扰  86
    4.3.4 线性回归分析及检测限  86-87
    4.3.5 分析应用  87-88
  4.4 小结  88-89
  参考文献  89-91
第五章 1,3,5,7-四甲基-8-丁酰哌嗪-二氟化硼-二吡咯甲烷柱前衍生HPLC分离荧光检测蔬菜样品中的植物激素  91-102
  5.1 引言  91-92
  5.2 实验部分  92-93
    5.2.1 实验仪器  92
    5.2.2 实验试剂  92
    5.2.3 实验方法  92-93
  5.3 结果与讨论  93-99
    5.3.1 色谱分离条件的优化  93-94
    5.3.2 共存物质干扰与排除  94-95
    5.3.3 衍生条件的优化  95-97
    5.3.4 线性回归分析及检测限  97
    5.3.5 样品分析  97-99
  5.4 结论  99-100
  参考文献  100-102
第六章 1,3,5,7-四甲基-8-丁酰哌嗪-二氟化硼-二吡咯甲烷柱前衍生毛细管电泳分离激光诱导荧光检测植物中的羧酸类植物激素  102-114
  6.1 引言  102-103
  6.2 实验部分  103-105
    6.2.1 实验仪器  103-104
    6.2.2 实验试剂  104
    6.2.3 实验方法  104-105
  6.3 结果与讨论  105-110
    6.3.1 毛细管电泳分离条件的优化  105-108
    6.3.2 植物激素衍生条件的优化  108-109
    6.3.3 最佳衍生条件  109-110
    6.3.4 线性回归分析及检测限  110
    6.3.5 6.3.4样品分析  110
  6.4 结论  110-112
  参考文献  112-114
第七章 6-氧-乙酰哌嗪荧光素柱前衍生CE分离激光诱导荧光检测水果中的七种植物激素  114-126
  7.1 引言  114-115
  7.2 实验部分  115-116
    7.2.1 实验仪器  115
    7.2.2 试剂  115-116
    7.2.3 实验方法  116
  7.3 结果与讨论  116-123
    7.3.1 电泳分离条件的优化  116-117
    7.3.2 有机溶剂含量的优化  117
    7.3.3 pH值的优化  117-118
    7.3.4 缓冲溶液浓度的优化  118-120
    7.3.5 水分对衍生物产率影响  120-121
    7.3.6 样品中干扰的排除  121-122
    7.3.7 线性回归分析及检测限  122
    7.3.8 分析应用  122-123
  7.4 结论  123-124
  参考文献  124-126
攻读博士学位期间发表论文（第一作者）  126-127
致谢  127

新荧光衍生试剂及其在羧基化合物的分析中的应用研究

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