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大草蛉卵黄原蛋白基因功能研究

作　者: 刘昌燕
导　师: 曾凡荣
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 大草蛉卵黄原蛋白基因克隆 RNA干扰基因功能研究
分类号: Q966
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

卵黄原蛋白是一种普遍存在于卵生非哺乳动物中的糖磷脂复合蛋白，该蛋白质在动物生殖发育过程中为胚胎发育提供营养和功能性物质，具有重要的生理功能。本研究克隆了脉翅目昆虫大草蛉卵黄原蛋白基因，探索了天敌昆虫大草蛉卵黄原蛋白基因的生理功能；同时本研究也克隆了大草蛉Housekeeping基因Actin，从转录和表达水平揭示了大草蛉卵黄原蛋白的发生过程；并进一步利用RNA干扰技术对卵黄原蛋白基因在大草蛉中的生理功能进行了系统研究。本研究获得的主要结果如下：1.利用RACE和RT-PCR技术从羽化后5-7d的雌成虫中克隆得到了大草蛉卵黄原蛋白编码基因。序列分析证实该卵黄原蛋白与其他昆虫卵黄原蛋白具有较高的同源性，具有卵黄原蛋白基因的各种保守结构域，将其命名为CSVg。2.利用RT-PCR和RACE技术克隆得到了大草蛉Actin基因，为大草蛉卵黄原蛋白基因的转录提供内参基因。RT-PCR鉴定表明在羽化后大草蛉雌雄虫中都存在卵黄原蛋白基因，在羽化后第4天大草蛉雌虫卵黄原蛋白基因开始转录，到第10天达到高峰，然后逐渐下降；在羽化后第4天的雄虫中也能检测到卵黄原蛋白基因的转录，但在不同时间内表达差异不显著。用ELISA对卵黄原蛋白的表达情况进行检测，发现卵黄原蛋白的表达与卵黄原蛋白基因的转录趋势相一致。3.选取大草蛉卵黄原蛋白基因4个不同区段的片段进行PCR扩增，成功构建了dsRNA原核表达载体并转化了大肠杆菌HT115，获得了CSVg dsRNA。4.通过显微注射将4个区段的CSVg dsRNA导入大草蛉成虫体内，以注射GFP dsRNA为对照，研究结果表明相比于对照，大草蛉卵黄原蛋白都有不同程度的降低，表明卵黄原蛋白基因被成功干扰；天敌昆虫大草蛉卵黄原蛋白基因生理功能研究表明：大草蛉雌虫卵黄原蛋白基因被干扰后，各处理组前5天的产卵总量和卵的孵化率都低于对照。

全文目录

附件  2-6
摘要  6-7
Abstract  7-15
英文缩略表  15-16
第一章引言  16-29
  1.1 昆虫卵黄原蛋白基因研究进展  16-22
    1.1.1 昆虫卵黄原蛋白  16
    1.1.2 昆虫卵黄原蛋白的结构特征  16-19
    1.1.3 昆虫卵黄原蛋白基因克隆方法  19-21
    1.1.4 昆虫卵黄原蛋白基因表达研究  21-22
    1.1.5 昆虫卵黄原蛋白基因功能研究  22
    1.1.6 大草蛉卵黄原蛋白研究概况  22
  1.2 RNA 干扰研究概况  22-26
    1.2.1 RNA 干扰技术的发现  22-23
    1.2.2 RNA 干扰的作用机制  23-24
    1.2.3 RNA 干扰的特点  24-25
    1.2.4 RNA 干扰的生物学功能  25-26
  1.3 昆虫 RNA 干扰  26-27
    1.3.1 RNA 干扰在昆虫中的应用  26-27
    1.3.2 昆虫 RNA 干扰的方法  27
  1.4 本研究的目的和意义  27-28
  1.5 本研究技术路线  28-29
第二章大草蛉卵黄原蛋白基因的克隆  29-48
  2.1 材料与方法  29-37
    2.1.1 实验材料  29
    2.1.2 菌株和质粒  29
    2.1.3 主要试剂和药品  29
    2.1.4 主要仪器  29
    2.1.5 主要溶液的配制  29-30
    2.1.6 卵黄原蛋白基因的克隆  30-37
    2.1.7 卵黄原蛋白基因的序列分析  37
    2.1.8 卵黄原蛋白基因的序列比对和系统发育树分析  37
  2.2 结果与分析  37-47
    2.2.1 卵黄原蛋白基因的克隆  37-44
    2.2.2 卵黄原蛋白基因的生物信息学分析  44-45
    2.2.3 卵黄原蛋白基因系统发育树的构建  45-47
  2.3 讨论  47-48
第三章大草蛉 HOUSEKEEPING 基因 ACTIN 的克隆及序列分析  48-57
  3.1 材料与方法  48-52
    3.1.1 实验材料  48
    3.1.2 菌株和质粒  48
    3.1.3 主要试剂和药品  48
    3.1.4 主要仪器  48
    3.1.5 主要溶液的配制  48-49
    3.1.6 Actin 基因的克隆  49-52
    3.1.7 Actin 基因的序列分析  52
  3.2 结果与分析  52-56
    3.2.1 Actin 基因的克隆  52-55
    3.2.2 Actin 基因生物信息学分析  55
    3.2.3 Actin 基因的系统发育分析  55-56
  3.3 讨论  56-57
第四章卵黄原蛋白基因在大草蛉体内转录、表达分析  57-70
  4.1 材料与方法  57-63
    4.1.1 实验材料  57
    4.1.2 菌株和质粒  57
    4.1.3 主要试剂和药品  57
    4.1.4 主要仪器  57-58
    4.1.5 主要溶液的配制  58-59
    4.1.6 卵黄原蛋白在大草蛉体内的转录分析  59-61
    4.1.7 卵黄原蛋白在大草蛉体内的表达分析  61-63
    4.1.8 数据分析  63
  4.2 结果与分析  63-69
    4.2.1 卵黄原蛋白基因在雌雄虫中的鉴定  63-64
    4.2.2 实时荧光定量 PCR 产物溶解曲线的分析  64-65
    4.2.3 卵黄原蛋白基因在雌虫羽化后不同时间转录分析  65
    4.2.4 卵黄原蛋白基因在雄虫羽化后不同时间转录分析  65-66
    4.2.5 卵黄原蛋白的 SDS-PAGE 电泳  66
    4.2.6 卵黄原蛋白的 Western blot 鉴定  66-67
    4.2.7 卵黄原蛋白在雌虫中的表达  67-68
    4.2.8 卵黄原蛋白在雄虫中的表达  68-69
  4.3 讨论  69-70
第五章卵黄原蛋白基因在大草蛉雌虫中的功能分析  70-86
  5.1 材料与方法  70-76
    5.1.1 菌株和质粒  70
    5.1.2 主要试剂和药品  70
    5.1.3 主要溶液的配制  70
    5.1.4 dsRNA 的原核表达  70-75
    5.1.5 RNA 干扰  75-76
  5.2 结果与分析  76-84
    5.2.1 干扰片段的 PCR 扩增  76-78
    5.2.2 质粒的酶切鉴定  78
    5.2.3 重组质粒的构建  78-79
    5.2.4 dsRNA 的诱导表达和提取  79-80
    5.2.5 显微注射不同体积 GFP dsRNA 后死亡率分析  80-81
    5.2.6 显微注射体积的确定  81
    5.2.7 不同 dsRNA 处理大草蛉雌成虫后卵黄原蛋白基因的表达量变化  81-82
    5.2.8 不同 dsRNA 处理大草蛉雌成虫后卵黄原蛋白的表达量变化  82
    5.2.9 不同 dsRNA 处理大草蛉后对雌成虫产卵持续时间的影响  82-83
    5.2.10 不同 dsRNA 处理大草蛉后对雌成虫前 5 天产卵总量的影响  83
    5.2.11 不同 dsRNA 处理后对卵孵化率的影响  83-84
  5.3 讨论  84-86
第六章全文结论  86-87
参考文献  87-97
致谢  97-98
作者简历  98

大草蛉卵黄原蛋白基因功能研究

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