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小鹅瘟病毒WH-12株的分离鉴定及其双抗夹心ELISA检测方法的建立

作　者: 郇长超
导　师: 茅翔；张训海
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 小鹅瘟病毒(GPV) VP3蛋白多克隆抗体双抗夹心ELISA
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

小鹅瘟(GP)也被称为Derzsy’s病,是由小鹅瘟病毒(学名为鹅细小病毒,Goose parvovirus, GPV)引起的一种主要侵害雏鹅和雏番鸭的高度接触性传染病。该病传播速度快,死亡率和发病率均高达90%-100%,随着雏鹅日龄的增长,发病率和死亡率都有所下降,其主要特征是小肠粘膜表层大片坏死脱落与渗出物凝成假膜栓子物堵塞于小肠,最大发病日龄为60日龄,其后常成隐性感染。本病一年四季均可发生流行,具有一定的季节性和周期性。目前,该病已成为危害养鹅业和养番鸭业中最主要传染病之一,给养殖业造成重大损失。本研究对疑似小鹅瘟临床病例进行了病原的分离鉴定,丰富了小鹅瘟的流行病学及病原学资料,为临床诊断提供依据。在病原分离鉴定的基础上,扩增了该分离株的全基因序列,进行了序列分析,为小鹅瘟病毒分子流行病学的的研究提供依据。此外,本研究通过构建重组质粒,表达结构蛋白VP3,建立了小鹅瘟病毒双抗夹心ELISA检测方法,旨在为基层防疫单位及流行病学调查提供了技术手段。主要研究内容：对来自安徽省五河县某养殖场所送检的病死和濒死小鹅进行的实验室检测,通过流行病学、临诊观察和剖检病变的检查,初步疑为小鹅瘟；同时,对病例的肝、脾、心、脑、肾等组织进行细菌学初检和病原学(细菌学和病毒学)的分离与病料的保存,并采用血凝试验、琼扩试验、PCR方法、动物回归试验等方法对该病原分离物进行鉴定,确诊为小鹅瘟病毒,命名为GPVWH-12株。根据GenBank中已公开发表的8株小鹅瘟病毒基因组序列,通过DNAstar软件进行序列对比,以同源性最高的JF333590序列分别设计并合成可覆盖其全序列的4对引物,分别进行PCR扩增、凝胶电泳鉴定和克隆与测序,用DNAStar软件将GPV各片段的测序结果进行拼接,得到GPVWH-12的全基因组序列,在NCBI上进行BLAST匕对和DNAStar软件作同源性分析,结果表明GPVWH-12株与KC478066株在同一分支中,其推导的核苷酸序列同源性也最高,达99.6%,而与HQ891825株的同源性最低,为93.8%。此外,根据JF333590设计并合成可完全覆盖结构蛋白VP3基因的引物,扩增1605bp的GPV VP3基因片段,构建了重组质粒pCold I-VP3并进行表达,表达产物经纯化和抗HIS标签的抗体进行Western-blot鉴定,用该蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,经纯化与生物活性的鉴定后进行双抗夹心ELISA的小鹅瘟抗原检测方法的建立,并从包被液、酶标二抗、封闭时间、显色时间、敏感性等方面进行优化,最后对其特异性、敏感性和PCR检测符合性进行比较。结果显示,所建立的GPV抗原双抗夹心ELISA检测方法最佳方案为：包被液为超纯水、酶标二抗浓度为1：1500、封闭液为1%的明胶,封闭时间为120min、显色时间为20min,该方法不与鹅流感等发生交叉反应,敏感性较好,与PCR检测方法的符合率为100%。

全文目录

目录  4-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略语及符号  10-11
第一章小鹅瘟病毒生物学特性及其诊断方法的研究进展  11-27
  1 小鹅瘟病毒的发现  11
  2 小鹅瘟病毒的特性  11-13
    2.1 小鹅瘟病毒的分类地位  11-12
    2.2 形态特征  12
    2.3 理化特性  12-13
    2.4 培养特性  13
  3 小鹅瘟病毒的分子生物学特性  13-15
    3.1 基因组结构特点  13-15
    3.2 基因组的转录和调节  15
  4 小鹅瘟病毒主要蛋白  15-17
    4.1 非结构蛋白  15-16
    4.2 结构蛋白  16-17
  5 小鹅瘟  17-18
    5.1 流行病学  17
    5.2 小鹅瘟的临床症状和病理变化  17-18
  6 小鹅瘟病毒的诊断方法  18-20
    6.1 病毒分离和鉴定  18-19
    6.2 血清学诊断  19-20
    6.3 分子生物学诊断  20
  7 小鹅瘟的防治  20
  8 研究目的及意义  20-21
  参考文献  21-27
第二章小鹅瘟病毒分离鉴定及全基因序列的测定  27-47
  摘要  27
  1 材料  27-28
    1.1 材料  27-28
  2 方法  28-35
    2.1 病料的采集及处理  28
    2.2 病料的鉴定  28-31
    2.3 病毒的增殖及传代  31
    2.4 病毒的分离鉴定  31-32
    2.5 动物回归试验  32
    2.6 GPV各片段的扩增与测序  32-34
    2.7 GPV全基因序列的拼接和分析  34-35
  3 结果  35-43
    3.1 病料的鉴定  35-36
    3.2 鹅胚的观察  36
    3.3 血凝试验(HA)  36
    3.4 琼脂扩散试验(AGP)  36-37
    3.5 PCR方法  37
    3.6 动物回归试验  37-38
    3.7 GPVWH-12各片段的扩增  38-39
    3.8 克隆的鉴定  39
    3.9 GPV基因序列的拼接  39-40
    3.10 全基因序列同源性的比较  40
    3.11 遗传进化分析  40-41
    3.12 GPV各基因核苷酸序列及推导氨基酸序列同源性比较  41-43
  4 讨论  43-46
  参考文献  46-47
第三章小鹅瘟病毒VP3蛋白多克隆抗体的制备与双抗夹心ELISA方法的建立  47-68
  摘要  47
  1 材料  47-48
    1.1 材料  47-48
  2 方法  48-57
    2.1 VP3基因引物的设计与扩增  48-50
    2.2 重组表达载体Pcold Ⅰ—VP3的构建  50-51
    2.3 VP3蛋白的表达及鉴定  51-53
    2.4 VP3蛋白浓度的测定  53-54
    2.5 抗VP3多克隆抗体的制备及鉴定  54-55
    2.6 双抗夹心ELISA方法反应条件的建立  55-57
  3 结果  57-66
    3.1 VP3基因扩增及鉴定  57-58
    3.2 VP3蛋白的表达  58
    3.3 VP3蛋白的纯化  58-59
    3.4 VP3蛋白Western-blot的鉴定  59-60
    3.5 VP3蛋白的浓度  60
    3.6 抗VP3多克隆抗体的纯化及鉴定  60-62
    3.7 双抗夹心ELISA方法反应条件的建立  62-66
  4 讨论  66-67
  参考文献  67-68
全文总结  68-69
附录一  69-73
附录二  73-77
致谢  77

小鹅瘟病毒WH-12株的分离鉴定及其双抗夹心ELISA检测方法的建立

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