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猪P58~(IPK)基因的克隆表达及甲型流感病毒感染对其表达的影响

作　者: 温俊歌
导　师: 张德礼
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: P58IPK 多克隆抗体 Western blotting qRT-PCR 免疫组化
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


P58IPK是干扰素诱导、dsRNA激活的蛋白激酶PKR的胞内抑制剂。流感病毒感染后P58IPK在翻译后水平激活,P58IPK的激活导致PKR介导的eIF-2α磷酸化水平降低,使病毒蛋白表达水平增高,对病毒复制有利。然而,敲除P58IPK的小鼠感染病毒后死亡率却显著升高,并有严重的肺部病变和炎症反应。本研究旨在分析猪P58IPK在流感病毒感染中的作用,具体实验内容与结果如下:1.本研究依照人P58IPK基因序列克隆得到猪源P58IPK基因,并用生物信息学分析猪源P58IPK的序列特征与进化关系。猪源P58IPK全长1 518 bp,编码505个氨基酸,蛋白的N端和C端高度保守,猪源P58IPK与人源P58IPK蛋白相似度高达99.21%。2.将P58IPK克隆到pET-32a原核表达载体上,转化到大肠杆菌表达菌BL21（DE3）中,在IPTG浓度为0.2 mmol/L,37℃诱导7 h时,融合蛋白His-P58IPK可溶性表达量最大,经HiTrapTM Chelating HP层析柱纯化后免疫新西兰大白兔,获得P58IPK的多克隆抗体。经检测多抗效价达到1:100000,具有特异反应性。3.将目的基因克隆到pEGFP-C1和pEGFP-N1真核表达载体上,采用脂质体转染法转染猪脐静脉血管内皮细胞（SUVECs）。在转染后24 h时融合蛋白EGFP-P58IPK-C1和P58IPK-EGFP-N1荧光表达量最大。根据荧光发光位置判定猪源P58IPK蛋白定位于细胞质,48 h后收集细胞进行裂解,Western blotting检测到融合蛋白EGFP-P58IPK和内源性P58IPK蛋白。4.甲型流感病毒株H1N1和H3N2分别感染健康猪,7 d后取猪肺脏组织,一部分提RNA并逆转录为cDNA,采用实时定量PCR方法检测P58IPK基因的变化,另一部分保存在4%的甲醛溶液中,做肺部病理组织学切片和P58IPK蛋白的免疫组织化学检测。结果表明感染病毒的猪肺脏组织发生明显病理变化,机体P58IPK的mRNA表达量和蛋白表达量在病毒感染后均上调。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-13
论文综述  13-26
  第一章 哺乳动物P58~(IPK)基因的研究进展  13-26
    1.1 DnaJ 基因家族研究进展  13-14
      1.1.1 DnaJ 基因家族的成员及命名  13
      1.1.2 DnaJ 基因家族的功能和作用机制  13-14
    1.2 DnaJ 家族蛋白P58~(IPK)研究进展  14-17
      1.2.1 DnaJ 家族蛋白P58~(IPK)的发现与结构特点  14
      1.2.2 DnaJ 家族蛋白P58~(IPK)的TPR 结构  14-16
      1.2.3 DnaJ 家族蛋白P58~(IPK)的DnaJ domain  16-17
    1.3 P58~(IPK)——病毒感染过程中宿主防御的细胞抑制剂“Cellular Inhibitors of the Host Defense”（CIHDs）  17-19
      1.3.1 P58~(IPK)对病毒复制的贡献  17-18
      1.3.2 P58~(IPK)在病毒感染过程中对宿主的贡献  18-19
    1.4 P58~(IPK)抑制PKR 介导的细胞凋亡  19-20
    1.5 P58~(IPK)基因在内质网应激反应中下调eIF-2α  20-21
    1.6 P58~(IPK)基因在内质网应激中抑制PERK  21
    1.7 P58~(IPK)基因调控未折叠蛋白应答（UPR）  21-22
    1.8 P58~(IPK)在内质网应激中发挥保护作用  22-23
    1.9 P58~(IPK)在柯萨基病毒（CV83）感染后UPR 作用网络中下调  23-24
    1.10 P58~(IPK)基因在植物中存在同源物  24
    1.11 P58~(IPK)蛋白的广泛表达  24-26
研究内容  26-67
  第二章 猪P58~(IPK)基因的克隆与序列分析  26-38
    2.1 材料  26-27
      2.1.1 样品来源  26-27
      2.1.2 工程菌种和质粒来源  27
      2.1.3 试剂和设备  27
      2.1.4 分子生物学分析软件和数据库  27
    2.2 方法  27-32
      2.2.1 电子克隆猪P58~(IPK)  27-28
      2.2.2 分子克隆猪P58~(IPK)  28-30
      2.2.3 阳性重组质粒菌液PCR 鉴定和测序  30-32
    2.3 结果与分析  32-37
      2.3.1 电子克隆猪P58~(IPK)结果  32
      2.3.2 PCR 产物P58~(IPK)电泳结果  32
      2.3.3 重组质粒pMD-P58~(IPK)菌液PCR 电泳结果  32-33
      2.3.4 pMD-P58~(IPK)测序结果与序列分析  33-34
      2.3.5 猪源P58~(IPK)外显子软件预测结果  34
      2.3.6 猪P58~(IPK)蛋白三级结构预测  34-35
      2.3.7 P58~(IPK)进化分析  35-36
      2.3.8 猪P58~(IPK)蛋白与其它物种蛋白的相似性分析结果  36-37
    2.4 讨论  37
    2.5 小结  37-38
  第三章 猪P58~(IPK)基因的原核表达、蛋白纯化与多抗制备  38-50
    3.1 材料  38-39
      3.1.1 试剂和酶  38
      3.1.2 工程菌和质粒  38
      3.1.3 仪器设备  38-39
    3.2 方法  39-44
      3.2.1 pET-P58~(IPK)重组载体的构建与鉴定  39-40
      3.2.2 pET-P58~(IPK)重组质粒转化表达菌 BL21 及鉴定  40
      3.2.3 pET-P58~(IPK)重组质粒阳性菌BL21 诱导表达  40
      3.2.4 SDS-PAGE 检测融合蛋白His-P58~(IPK)表达  40-41
      3.2.5 His-P58~(IPK)融合蛋白的纯化  41-42
      3.2.6 P58~(IPK)融合蛋白抗血清制备  42
      3.2.7 P58~(IPK)多抗效价检测  42-43
      3.2.8 Western Blotting 检测His-P58~(IPK)融合蛋白的表达  43
      3.2.9 免疫荧光检测P58~(IPK)多抗对天然抗原的识别  43-44
    3.3 结果与分析  44-48
      3.3.1 重组质粒pET-P58~(IPK)酶切鉴定结果  44
      3.3.2 IPTG 诱导His-P58~(IPK)融合蛋白表达SDS-PAGE 分析结果  44-45
      3.3.3 His-P58~(IPK)重组蛋白纯化后SDS-PAGE 分析结果  45-46
      3.3.4 多抗效价检测结果  46-47
      3.3.5 Western Blotting 检测His-P58~(IPK)融合蛋白表达的结果  47
      3.3.6 免疫荧光检测P58~(IPK)多抗对天然抗原的识别结果  47-48
    3.4 讨论  48
    3.5 小结  48-50
  第四章 猪P58~(IPK)基因在SUVEC 细胞中表达  50-58
    4.1 材料  50
      4.1.1 载体、细胞和菌种  50
      4.1.2 酶和试剂  50
      4.1.3 主要仪器  50
    4.2 方法  50-54
      4.2.1 构建P58~(IPK)-pEGFP-C1 和pEGFP-P58~(IPK)-N1 重组真核表达载体  50-53
      4.2.2 细胞培养和质粒转染  53
      4.2.3 Western blotting 检测过表达和内源性P58~(IPK)蛋白  53-54
    4.3 结果与分析  54-57
      4.3.1 重组质粒pEGFP-P58~(IPK)-C1、P58~(IPK)-pEGFP-N1 双酶切鉴定和测序结果  54-55
      4.3.2 重组质粒浓度检测结果  55
      4.3.3 猪脐静脉血管内皮细胞形态观察  55
      4.3.4 重组质粒转染猪脐静脉血管内皮细胞形态观察  55-56
      4.3.5 Western blotting 检测结果  56-57
    4.4 讨论  57
    4.5 小结  57-58
  第五章 甲型H1N1 和H3N2 流感病毒株感染猪后对P58~(IPK)基因表达的影响  58-67
    5.1 材料  58-59
      5.1.1 实验动物  58
      5.1.2 主要试剂  58-59
      5.1.3 试验仪器  59
    5.2 方法  59-62
      5.2.1 取材与固定  59
      5.2.2 HE 病理切片的制备  59-60
      5.2.3 qRT-PCR 检测染毒后猪肺脏中P58~(IPK)的mRNA 变化  60-61
      5.2.4 P58~(IPK)免疫组织化学  61-62
    5.3 结果  62-65
      5.3.1 猪感染流感病毒肺部病理切片的HE 染色结果  62
      5.3.2 qRT-PCR 检测结果  62-64
      5.3.3 猪感染流感病毒肺部病理切片P58~(IPK)免疫组化结果  64
      5.3.4 猪感染流感病毒后肺部组织P58~(IPK)免疫组化相对表达量差异分析结果..  64-65
    5.4 讨论  65
    5.5 小结  65-67
结论  67-68
参考文献  68-76
附录1  76-78
附录2  78-81
缩略词  81-82
致谢  82-83
个人简介  83

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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