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地衣芽孢杆菌GXT-1两个碱性蛋白酶基因的克隆表达、酶学性质研究及分子改造

作　者: 雷攀先
导　师: 韦宇拓
学　校: 广西大学
专　业: 微生物学
关键词: 筛选分离 地衣芽孢杆菌 GXT-1 碱性蛋白酶 克隆表达 酶学特性 分子改造
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


碱性蛋白酶作为一种工业上非常重要的酶类,占据全球酶市场的30%,获得新型优良的碱性蛋白酶基因,深化碱性蛋白酶的研究理论,对碱性蛋白酶的开发和应用具有重要的意义。本研究从自然界筛选到一株产耐碱性蛋白酶的野生菌株,初步鉴定为地衣芽孢菌属,命名为Bacillus licheniformis GXT-1。并成功地从该菌株的基因组DNA中克隆到二个碱性蛋白酶基因bll、bl2,在大肠杆菌成功表达并通过镍柱亲和层析获得纯化重组酶BL1、BL2,其中BL1成熟的酶蛋白分子量大小为33KD,BL2成熟的酶蛋白分子量大小为27KD。酶学性质研究表明BL1、BL2都属于蛋白酶S8家族。以酪蛋白为底物时,BL1的最适反应pH为10.0,在pH7.0-pH11.0有80%以上的相对活力,最适反应温度温度为70℃,比活为14643U/mg,Km值为3.80mg/mL,最大反应速度Vmax为19803U/mg。BL2的最适反应pH为10.0,在pH8.0-pH11有80%以上的相对活力,最适反应温度温度为70℃,比活为21855U/mg,Km值为13.59mg/mL,最大反应速度Vmax为48278U/mg。利用反向PCR对重组酶BL1、BL2进行初步分子改造,得到7个突变子M94S、M248S、M255S、M284S以及M118A、M134S、M221S,其中突变子M94S和M134S酶活缺失,M248S、M255S、M118A、M221S的Km值有所降低,但只有M248S突变子比活提高,其他突变子的比活都有所降低。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章 前言  11-24
  1.1 蛋白酶的概述及分类  11
  1.2 碱性蛋白酶蛋白酶  11-18
    1.2.1 碱性蛋白酶蛋白酶的来源  11-12
    1.2.2 碱性蛋白质结构特点及活性中心  12-14
    1.2.3 碱性蛋白酶的空间结构和反应机理  14-15
    1.2.4 碱性蛋白酶的性质  15-18
  1.3 碱性蛋白酶的应用  18-20
  1.4 碱性蛋白酶的分子改造研究概况  20-21
    1.4.1 酶的分子改造  20
    1.4.2 酶分子改造策略  20-21
    1.4.3 碱性蛋白酶的分子改造  21
  1.5 研究背景和意义  21-23
  1.6 技术路线  23-24
第二章 材料与方法  24-35
  2.1 材料  24-25
    2.1.1 土样的采集  24
    2.1.2 菌株与质粒  24
    2.1.3 主要酶和试剂  24
    2.1.4 主要仪器和设备  24
    2.1.5 培养基  24-25
  2.2 方法与步骤  25-35
    2.2.1 产碱性蛋白酶菌株的筛选  25
    2.2.2 筛选菌株总DNA的提取及制备  25
    2.2.3 菌株的16SrDNA鉴定  25-26
    2.2.4 感受态细胞的制备  26
    2.2.5 质粒的提取  26
    2.2.6 DNA的酶切和连接  26
    2.2.7 DNA连接产物的转化  26
    2.2.8 碱性蛋白酶的基因克隆  26-30
    2.2.9 重组质粒的验证  30
    2.2.10 蛋白酶的诱导表达  30-31
    2.2.11 蛋白酶的纯化  31
    2.2.12 蛋白质SDS-PAGE电泳  31
    2.2.13 蛋白含量的测定  31-32
    2.2.14 酪氨酸标准曲线的绘制  32-33
    2.2.15 蛋白酶酶活力的测定  33-34
    2.2.16 碱性蛋白酶酶学性质的研究  34
    2.2.17 碱性蛋白酶BL1、BL2的分子改造  34-35
第三章 结果与分析  35-63
  3.1 产碱性蛋白酶菌株的筛选  35
  3.2 GXT-1总DNA的制备  35-36
  3.3 GXT-1菌株16S RDNA的鉴定  36-37
  3.4 碱性蛋白酶BL1的克隆表达及酶学性质  37-47
    3.4.1 碱性蛋白酶BL1的信号肽预测  37-38
    3.4.2 碱性蛋白酶基因bl1的克隆  38-39
    3.4.3 pET22b(+)-bl1重组质粒的构建  39
    3.4.4 pET22b(+)-bl1重组质粒的验证  39-41
    3.4.5 碱性蛋白酶BL1的表达及纯化  41
    3.4.6 碱性蛋白酶BL1的酶学性质  41-47
  3.6 碱性蛋白酶BL2的克隆表达及酶学性质  47-57
    3.6.1 碱性蛋白酶BL2的信号肽预测  47-49
    3.6.2 碱性蛋白酶bl2基因的克隆  49
    3.6.3 pET22b(+)-bl2重组质粒的构建  49
    3.6.4 pET22b(+)-bl2重组质粒的验证  49-51
    3.6.5 BL2碱性蛋白酶的表达及纯化  51
    3.6.6 碱性蛋白酶BL2的酶学性质  51-57
  3.7 碱性蛋白酶基因BL1、BL2的分子改造  57-63
    3.7.1 碱性蛋白酶BL1同源建模及突变点的选择  57-58
    3.7.2 bl1反向PCR  58-59
    3.7.3 BL2突变酶的纯化及SDS-PAGE分析  59-60
    3.7.4 BL1野生型和突变型酶的比活力测定  60
    3.7.5 碱性蛋白酶BL2同源建模及突变点的选择  60-61
    3.7.6 bl2反向PCR  61
    3.7.7 BL2突变酶的纯化及SDS-PAGE分析  61-62
    3.7.8 BL2野生型和突变型酶的比活力测定  62-63
第四章 讨论  63-65
  4.1 产碱性蛋白酶菌株BACILLUS LICHENIFORMIS GXT-1的筛选鉴定  63
  4.2 BACILLUS LICHENIFORMIS GXT-1碱性蛋白酶的克隆表达和酶学性质  63-64
  4.3 碱性蛋白酶的分子改造  64-65
第五章 结论与展望  65-67
  5.1 结论  65
  5.2 问题与展望  65-67
参考文献  67-77
附录1  77-79
附录2  79-82
附录3  82-85
致谢  85-86
攻读硕士学位期间发表的学术论文目录  86

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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