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通过定点突变提高米曲霉乳糖酶的热稳定性的研究

作　者: 杨萍
导　师: 张伟
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 米曲霉乳糖酶热稳定性定点突变分子改造
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

β-半乳糖苷酶(β-D-galactoside galatohdrolase,EC 3.2.1.23)俗称乳糖酶(lactase),是一种重要的糖苷水解酶。该酶能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖,可用于生产低乳糖制品来缓解因乳糖酶缺乏造成的乳糖消化不良和乳糖不耐受症;同时,还可利用该酶的转糖苷作用生产具有保健作用的低聚半乳糖。近年来,乳糖酶在低乳糖牛奶和低聚半乳糖生产过程中的应用技术已渐趋成熟,市场需求量逐年递增,因此对乳糖酶的研究不仅具有重要的理论意义,而且预期能够产生巨大的社会效益和经济价值。本研究以一个来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的乳糖酶LACH为出发点,为了提高该酶的热稳定性,通过同源建模的方法预测了其蛋白三维空间结构,并对其活性中心进行了分析,利用生物信息学软件分析了可能影响该酶热稳定性的氨基酸位点。通过单点突变和组合突变对其基因进行定向分子改良,将突变酶在毕赤酵母中进行表达纯化,然后对其酶学性质进行分析以确定突变效果。本实验共获得了十八个突变酶,将这些突变酶与野生型酶的热稳定性进行比较发现,经分子改良后的突变酶的热稳定性有着不同程度的改变。LACH中第211位氨基酸对其热稳定性有显著影响。将该位点的Thr分别突变成不同性质的氨基酸后发现,当突变为Asn,Asp,Ser或Gly后,突变酶的热稳定性有所提高,而当此位点突变为Pro(T211P)后热稳定性提高幅度最为显著,在60℃保温40分钟后仍有90%以上的酶活。60℃条件下的半衰期由野生酶的2.06 min提高到了177.73 min。而且T211P的Kcat/Km值与野生酶相比也有明显的提高,由1.19×103提高到了2.23×103。突变体L117P,S162P,G207P和G246P-248P的热稳定性没有提高,但是其最适反应温度有不同程度的降低。L117P和G207P的最适反应温度由60℃降低到了50℃,而S162P和G246P-248P的最适反应温度由60℃降低到了40℃。本研究通过基因工程手段,定向改良了乳糖酶LACH,使其热稳定性有了很大的提高。而且通过研究发现第211位的氨基酸对乳糖酶LACH的热稳定性的影响很大。研究中获得的一系列突变酶也为指导乳糖酶的进一步改良提供了良好的研究材料。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-11
第一章引言  11-22
  1.1 乳糖酶的简介  11-14
    1.1.1 研究背景  11
    1.1.2 乳糖酶的来源与性质  11-13
    1.1.3 乳糖酶国内外研究现状  13-14
  1.2 酶的热稳定机制和分子改造策略研究进展  14-21
    1.2.1 酶热稳定性的概念  15
    1.2.2 影响酶热稳定性的因素  15-18
    1.2.3 提高蛋白质热稳定性的策略  18-21
  本研究的目的和意义  21-22
第二章提高乳糖酶热稳定性突变位点的预测与设计  22-51
  2.1 材料  22-25
    2.1.1 菌种与载体  22
    2.1.2 工具酶  22
    2.1.3 试剂  22
    2.1.4 培养基及有关溶液的配制  22-24
    2.1.5 寡核苷酸引物  24
    2.1.6 主要仪器  24-25
  2.2 研究方法  25-36
    2.2.1 乳糖酶LACH 的同源建模  25
    2.2.2 乳糖酶LACH 的分子动力学曲线模拟  25
    2.2.3 突变位点以及突变氨基酸的确定  25
    2.2.4 突变方法  25-27
    2.2.5 pPIC9-H’表达载体（H’指任意突变酶基因）的构建  27-28
    2.2.6 含 pPIC9-H’表达载体克隆子的筛选  28-29
    2.2.7 重组乳糖酶的表达及纯化  29-31
    2.2.8 乳糖酶活性的测定  31-33
    2.2.9 酶学性质的分析与比较  33-36
  2.3 结果  36-48
    2.3.1 乳糖酶的同源建模  36
    2.3.2 乳糖酶LACH 分子动力学曲线的测定及突变位点的确定  36-38
    2.3.3 单点突变  38-44
    2.3.4 组合突变  44-48
      2.3.4.1 定点突变  44
      2.3.4.2 重组表达质粒的构建  44
      2.3.4.3 突变酶的表达纯化  44-45
      2.3.4.4 突变酶酶学性质的分析与比较  45-48
      2.3.4.5 乳糖酶 K_m 和 K_(cat) 值的测定  48
  2.4 讨论  48-51
    2.4.1 T211P，G246P，G248P，G207P 定点突变  48-49
    2.4.2 L117P，S162P 定点突变  49-50
    2.4.3 组合突变  50-51
第三章第211 位氨基酸对乳糖酶LACH 热稳定性的影响  51-57
  3.1 材料  51
    3.1.1 寡核苷酸引物  51
  3.2 方法  51-52
  3.3 结果  52-55
    3.3.1 定点突变  52
    3.3.2 重组表达质粒的构建  52
    3.3.3 八个突变体的表达和纯化  52-53
    3.3.4 八种重组乳糖酶酶学性质的分析与比较  53-55
  3.4 讨论  55-57
第四章全文结论  57-59
参考文献  59-64
致谢  64-65
作者简历  65

通过定点突变提高米曲霉乳糖酶的热稳定性的研究

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