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酯酶的克隆、表达、筛选以及立体选择性的定向进化研究
作 者: 汤晓玲
导 师: 于洪巍
学 校: 浙江大学
专 业: 生物化工
关键词: 酯酶 克隆 表达 手性选择性 定向进化 高通量筛选
分类号: Q814
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
酯酶(EC3.1.1.x)是能够催化一系列酯键生成相应的酸和醇的重要生物催化剂。其在有机溶剂中有较好的稳定性、活性及立体选择性,因此被广泛用于合成食品添加剂、农用化学品和医药中间体等重要化合物。在本课题中,我们采用分子克隆手段,从大肠杆菌K-12中克隆表达出一系列的酯酶并且研究其性质。另外我们通过定向进化对该类酶进行改造,获得了立体选择性得到明显提高的酯酶。通过GenBank数据库分析,从大肠杆菌K-12中筛选了酯酶基因,经PCR扩增后,获得了31个不同的酯酶基因片段,用内切酶双酶切后,与经过相同的限制性内切酶切割的载体pET-30a(+)连接,转化到大肠杆菌BL21中。重组菌在IPTG的诱导下表达,经过SDS-PAGE分析后,获得了相应的目标蛋白。建立了一种结合酯酶活性与立体选择性的高效筛选策略。以4-硝基苯丁酸酯为活性筛选的底物,通过检测405nm下的吸光度,获得了5个活性较好的酯酶(XL3,XL10, XL15,XL27,XL31).再以1-乙酸苯乙酯作为底物进行立体选择性筛选,以1 mmol/L溴百里香芬兰作为指示剂,利用酶标仪在630 nm下检测各个酶催化水解反应中吸光度的变化,获得了对1-乙酸苯乙酯具有较高立体选择性的酯酶XL15。利用1-乙酸苯乙酯的水解反应和酯化反应对XL15进行复筛,转化率分别达到31.2%和36.8%,其对映体选择性(E值)均大于100。在对克隆获得酯酶的酶学性质的研究中发现,对于短链4-硝基苯酯,上述5个酯酶均具有较高的活性,但对于长链4-硝基苯酯,酶的活性明显下降。不同的酶的最佳反应pH值和反应温度亦不同。通过对酯酶XL15进行诱导表达条件的优化,获得了最佳蛋白表达条件:IPTG浓度为0.1mmol/L,诱导前菌体生长量为OD600=0.7,诱导温度为30℃。进一步对酯酶XL15进行蛋白纯化,获得了大小为28kDa的目标条带。通过序列分析与比对,XL15属于α/β/α水解酶结构,具有典型的Ser-His-Asp活性位点。初步预测表明,其活性中心附近存在一个类似“口袋”的结构,对于R-乙酸苯乙酯,手性碳上苯环的指向使得甲基能够比较好地契合到小口袋中,从而使该酶具有对R-乙酸苯乙酯较好的立体选择性。为了提高酯酶的立体选择性,我们采用了定向进化手段。所研究的酶为来自红球菌Rhodobacter sphaeroides的RSP 2728酯酶。整个过程中,我们建立了有效的定向进化策略和高通量筛选方法。利用易错PCR技术,进行了四轮突变,获得了突变株A6A5, B7F11, C8G1和D3E11,在对扁桃酸甲酯的水解反应中,其立体选择性相比较于野生菌株,对映体选择率(E值)从3.1分别提高到5.3,8.8,14.0和30.8;活性相对于野生菌株,从10U/mg分别提高到43 U/mg,142U/mg,88 U/mg和24 U/mg。序列分析表明,突变体A6A5的62位上的氨基酸发生了突变,由原先的天冬酰胺变成了酪氨酸;突变体B7F11的62位上的氨基酸由天冬酰胺变为了酪氨酸,145位上的亮氨酸变成了组氨酸;突变体C8G1的62位上的氨基酸由天冬酰胺变为了半胱氨酸,145位上的亮氨酸变成了组氨酸;D3E11的62位上的氨基酸由天冬酰胺变为了半胱氨酸,121位的甲硫氨酸变成了颉氨酸,145位上的亮氨酸变成了组氨酸。由此可见,利用定向进化策略能够有效地提高酶的立体选择性。
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全文目录
致谢 4-5 摘要 5-7 Abstract 7-14 1. 文献综述 14-29 1.1 酯酶 14-16 1.1.1 酯酶的分类和来源 14 1.1.2 酯酶的立体结构和催化机制 14-16 1.1.3 酯酶的工业应用 16 1.2 酶的立体选择性在手性药物合成中的重要性 16-18 1.2.1 手性药物的研究意义 16-17 1.2.2 手性药物的生物活性差异 17 1.2.3 酶催化消旋体拆分合成手性化合物 17-18 1.3 酶的定向进化研究 18-29 1.3.1 酶的定向进化的内涵 18-19 1.3.2 定向进化的原理与目的 19 1.3.3 酶定向进化的关键问题 19-20 1.3.4 酶定向进化中突变文库的建立 20-25 1.3.4.1 非重组方法构建突变库 20-21 1.3.4.2 重组方法构建突变库 21-25 1.3.5 酶定向进化中表达系统的选择 25-26 1.3.6 定向进化工程中高通量筛选模型的建立 26-27 1.3.7 蛋白质定向进化的研究进展 27-28 1.3.8 计算机技术对于酶改造的辅助作用 28 1.3.9 定向进化技术的展望 28-29 2. 酯酶的克隆与表达 29-46 2.1 材料与方法 29-38 2.1.1 材料 29-30 2.1.1.1 菌株与质粒 29 2.1.1.2 工具酶 29 2.1.1.3 试剂 29-30 2.1.1.4 主要仪器 30 2.1.2 实验方法 30-38 2.1.2.1 模板基因组的提取 30-31 2.1.2.2 琼脂糖凝胶电泳 31-32 2.1.2.3 质粒pET-30a(+)的提取与纯化 32 2.1.2.4 酯酶基因的选择与引物设计和合成 32-33 2.1.2.5 酯酶基因的纯化、酶切以及与pET-30a(+)的连接 33-34 2.1.2.6 大肠杆菌BL21感受态的制备以及转化 34-35 2.1.2.7 重组子的鉴定 35 2.1.2.8 重组蛋白的表达 35-36 2.1.2.9 SDS-PAGE蛋白电泳 36-38 2.1.2.10 Bradford法测定蛋白浓度 38 2.2 结果 38-44 2.2.1 酯酶基因的扩增 38-41 2.2.2 重组表达载体的构建 41-43 2.2.2.1 表达载体和宿主细胞的选择 41-42 2.2.2.2 重组表达载体pET-30a(+)系列的构建思路 42-43 2.2.3 重组表达载体PET30a(+)-xln的诱导表达 43 2.2.4 重组蛋白酶的浓度测定 43-44 2.3 讨论 44-45 2.4 结论 45-46 3. 酯酶活性和立体选择性的筛选 46-58 3.1 材料与方法 46-51 3.1.1 材料 46-47 3.1.1.1 菌株与酶 46-47 3.1.1.3 主要实验设备 47 3.1.2 实验方法 47-51 3.1.2.1 酶溶液以及酶粉的获得 48 3.1.2.2 酯酶活力的测定 48-49 3.1.2.3 酯酶底物特异性的测定 49 3.1.2.4 温度对酯酶酶活的影响 49 3.1.2.5 反应pH值对酯酶酶活的影响 49 3.1.2.6 酯酶立体选择性的高通量筛选方法 49-50 3.1.2.7 酯酶立体选择性的复筛 50 3.1.2.8 气相分析条件 50-51 3.2 结果 51-57 3.2.1 酯酶活性的筛选结果 51-52 3.2.2 酯酶立体选择性的高通量筛选结果 52-54 3.2.2.1 高通量筛选模型的建立 52 3.2.2.2 酯酶立体选择性的筛选结果 52-53 3.2.2.3 酯酶立体选择性的复筛和气相分析 53-54 3.2.3 酯酶的底物特异性 54-55 3.2.4 温度和PH对酯酶活力的影响 55-57 3.3 讨论 57 3.4 结论 57-58 4. 酯酶诱导表达条件的优化和蛋白纯化 58-72 4.1 材料与方法 59-62 4.1.1 材料 59-60 4.1.1.1 菌株 59 4.1.1.2 试剂 59-60 4.1.1.3 主要设备 60 4.1.2 实验方法 60-62 4.1.2.1 菌株活化与培养 60 4.1.2.2 菌体生物量的测定 60 4.1.2.3 IPTG浓度对蛋白表达的影响研究 60 4.1.2.4 诱导温度对蛋白表达的影响研究 60-61 4.1.2.5 不同的菌体生长程度对蛋白表达的影响 61 4.1.2.6 蛋白表达的测定 61 4.1.2.7 蛋白含量的测定 61 4.1.2.8 蛋白质分离纯化 61-62 4.2 结果 62-70 4.2.1 IPTG浓度对目的蛋白表达的影响 62-63 4.2.2 不同菌体生长阶段对目的蛋白表达的影响 63-65 4.2.3 诱导温度对目的蛋白表达的影响 65-66 4.2.4 酯酶XL15目标蛋白的分离与纯化 66 4.2.5 对酯酶XL15进行结构上的对比与分析 66-70 4.3 讨论 70-71 4.4 结论 71-72 5. 通过定向进化提高酯酶立体选择性的研究 72-84 5.1 材料与方法 72-76 5.1.1 材料 72-73 5.1.1.1 菌株和质粒 72 5.1.1.2 工具酶 72-73 5.1.1.3 试剂 73 5.1.1.4 主要设备 73 5.1.2 实验方法 73-76 5.1.2.1 易错PCR与突变文库的构建 73-74 5.1.2.2 RSP_2728酯酶突变体的诱导表达 74 5.1.2.3 阳性克隆手性选择性的初筛 74-75 5.1.2.4 阳性克隆手性选择性的复筛 75 5.1.2.5 蛋白质含量测定 75 5.1.2.6 分析方法 75-76 5.2 结果 76-83 5.2.1 易错PCR条件的确定 76-77 5.2.2 突变体文库的构建 77 5.2.3 突变体的筛选与鉴定 77-79 5.2.3.1 突变体的高通量筛选模型 77-78 5.2.3.2 突变体初筛与复筛结果 78-79 5.2.4 活性与立体选择性的进化过程 79-80 5.2.5 活性与立体选择性的进化过程 80-81 5.2.6 突变基因的序列分析 81-83 5.3 讨论 83 5.4 结论 83-84 6. 结论与展望 84-87 6.1 结论 84-85 6.2 展望 85-87 参考文献 87-92 附录 92-94
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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学(生物技术) > 酶工程
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