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酯酶的克隆、表达、筛选以及立体选择性的定向进化研究

作 者: 汤晓玲
导 师: 于洪巍
学 校: 浙江大学
专 业: 生物化工
关键词: 酯酶 克隆 表达 手性选择性 定向进化 高通量筛选
分类号: Q814
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


酯酶(EC3.1.1.x)是能够催化一系列酯键生成相应的酸和醇的重要生物催化剂。其在有机溶剂中有较好的稳定性、活性及立体选择性,因此被广泛用于合成食品添加剂、农用化学品和医药中间体等重要化合物。在本课题中,我们采用分子克隆手段,从大肠杆菌K-12中克隆表达出一系列的酯酶并且研究其性质。另外我们通过定向进化对该类酶进行改造,获得了立体选择性得到明显提高的酯酶。通过GenBank数据库分析,从大肠杆菌K-12中筛选了酯酶基因,经PCR扩增后,获得了31个不同的酯酶基因片段,用内切酶双酶切后,与经过相同的限制性内切酶切割的载体pET-30a(+)连接,转化到大肠杆菌BL21中。重组菌在IPTG的诱导下表达,经过SDS-PAGE分析后,获得了相应的目标蛋白。建立了一种结合酯酶活性与立体选择性的高效筛选策略。以4-硝基苯丁酸酯为活性筛选的底物,通过检测405nm下的吸光度,获得了5个活性较好的酯酶(XL3,XL10, XL15,XL27,XL31).再以1-乙酸苯乙酯作为底物进行立体选择性筛选,以1 mmol/L溴百里香芬兰作为指示剂,利用酶标仪在630 nm下检测各个酶催化水解反应中吸光度的变化,获得了对1-乙酸苯乙酯具有较高立体选择性的酯酶XL15。利用1-乙酸苯乙酯的水解反应和酯化反应对XL15进行复筛,转化率分别达到31.2%和36.8%,其对映体选择性(E值)均大于100。在对克隆获得酯酶的酶学性质的研究中发现,对于短链4-硝基苯酯,上述5个酯酶均具有较高的活性,但对于长链4-硝基苯酯,酶的活性明显下降。不同的酶的最佳反应pH值和反应温度亦不同。通过对酯酶XL15进行诱导表达条件的优化,获得了最佳蛋白表达条件:IPTG浓度为0.1mmol/L,诱导前菌体生长量为OD600=0.7,诱导温度为30℃。进一步对酯酶XL15进行蛋白纯化,获得了大小为28kDa的目标条带。通过序列分析与比对,XL15属于α/β/α水解酶结构,具有典型的Ser-His-Asp活性位点。初步预测表明,其活性中心附近存在一个类似“口袋”的结构,对于R-乙酸苯乙酯,手性碳上苯环的指向使得甲基能够比较好地契合到小口袋中,从而使该酶具有对R-乙酸苯乙酯较好的立体选择性。为了提高酯酶的立体选择性,我们采用了定向进化手段。所研究的酶为来自红球菌Rhodobacter sphaeroides的RSP 2728酯酶。整个过程中,我们建立了有效的定向进化策略和高通量筛选方法。利用易错PCR技术,进行了四轮突变,获得了突变株A6A5, B7F11, C8G1和D3E11,在对扁桃酸甲酯的水解反应中,其立体选择性相比较于野生菌株,对映体选择率(E值)从3.1分别提高到5.3,8.8,14.0和30.8;活性相对于野生菌株,从10U/mg分别提高到43 U/mg,142U/mg,88 U/mg和24 U/mg。序列分析表明,突变体A6A5的62位上的氨基酸发生了突变,由原先的天冬酰胺变成了酪氨酸;突变体B7F11的62位上的氨基酸由天冬酰胺变为了酪氨酸,145位上的亮氨酸变成了组氨酸;突变体C8G1的62位上的氨基酸由天冬酰胺变为了半胱氨酸,145位上的亮氨酸变成了组氨酸;D3E11的62位上的氨基酸由天冬酰胺变为了半胱氨酸,121位的甲硫氨酸变成了颉氨酸,145位上的亮氨酸变成了组氨酸。由此可见,利用定向进化策略能够有效地提高酶的立体选择性。

全文目录


致谢  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-14
1. 文献综述  14-29
  1.1 酯酶  14-16
    1.1.1 酯酶的分类和来源  14
    1.1.2 酯酶的立体结构和催化机制  14-16
    1.1.3 酯酶的工业应用  16
  1.2 酶的立体选择性在手性药物合成中的重要性  16-18
    1.2.1 手性药物的研究意义  16-17
    1.2.2 手性药物的生物活性差异  17
    1.2.3 酶催化消旋体拆分合成手性化合物  17-18
  1.3 酶的定向进化研究  18-29
    1.3.1 酶的定向进化的内涵  18-19
    1.3.2 定向进化的原理与目的  19
    1.3.3 酶定向进化的关键问题  19-20
    1.3.4 酶定向进化中突变文库的建立  20-25
      1.3.4.1 非重组方法构建突变库  20-21
      1.3.4.2 重组方法构建突变库  21-25
    1.3.5 酶定向进化中表达系统的选择  25-26
    1.3.6 定向进化工程中高通量筛选模型的建立  26-27
    1.3.7 蛋白质定向进化的研究进展  27-28
    1.3.8 计算机技术对于酶改造的辅助作用  28
    1.3.9 定向进化技术的展望  28-29
2. 酯酶的克隆与表达  29-46
  2.1 材料与方法  29-38
    2.1.1 材料  29-30
      2.1.1.1 菌株与质粒  29
      2.1.1.2 工具酶  29
      2.1.1.3 试剂  29-30
      2.1.1.4 主要仪器  30
    2.1.2 实验方法  30-38
      2.1.2.1 模板基因组的提取  30-31
      2.1.2.2 琼脂糖凝胶电泳  31-32
      2.1.2.3 质粒pET-30a(+)的提取与纯化  32
      2.1.2.4 酯酶基因的选择与引物设计和合成  32-33
      2.1.2.5 酯酶基因的纯化、酶切以及与pET-30a(+)的连接  33-34
      2.1.2.6 大肠杆菌BL21感受态的制备以及转化  34-35
      2.1.2.7 重组子的鉴定  35
      2.1.2.8 重组蛋白的表达  35-36
      2.1.2.9 SDS-PAGE蛋白电泳  36-38
      2.1.2.10 Bradford法测定蛋白浓度  38
  2.2 结果  38-44
    2.2.1 酯酶基因的扩增  38-41
    2.2.2 重组表达载体的构建  41-43
      2.2.2.1 表达载体和宿主细胞的选择  41-42
      2.2.2.2 重组表达载体pET-30a(+)系列的构建思路  42-43
    2.2.3 重组表达载体PET30a(+)-xln的诱导表达  43
    2.2.4 重组蛋白酶的浓度测定  43-44
  2.3 讨论  44-45
  2.4 结论  45-46
3. 酯酶活性和立体选择性的筛选  46-58
  3.1 材料与方法  46-51
    3.1.1 材料  46-47
      3.1.1.1 菌株与酶  46-47
      3.1.1.3 主要实验设备  47
    3.1.2 实验方法  47-51
      3.1.2.1 酶溶液以及酶粉的获得  48
      3.1.2.2 酯酶活力的测定  48-49
      3.1.2.3 酯酶底物特异性的测定  49
      3.1.2.4 温度对酯酶酶活的影响  49
      3.1.2.5 反应pH值对酯酶酶活的影响  49
      3.1.2.6 酯酶立体选择性的高通量筛选方法  49-50
      3.1.2.7 酯酶立体选择性的复筛  50
      3.1.2.8 气相分析条件  50-51
  3.2 结果  51-57
    3.2.1 酯酶活性的筛选结果  51-52
    3.2.2 酯酶立体选择性的高通量筛选结果  52-54
      3.2.2.1 高通量筛选模型的建立  52
      3.2.2.2 酯酶立体选择性的筛选结果  52-53
      3.2.2.3 酯酶立体选择性的复筛和气相分析  53-54
    3.2.3 酯酶的底物特异性  54-55
    3.2.4 温度和PH对酯酶活力的影响  55-57
  3.3 讨论  57
  3.4 结论  57-58
4. 酯酶诱导表达条件的优化和蛋白纯化  58-72
  4.1 材料与方法  59-62
    4.1.1 材料  59-60
      4.1.1.1 菌株  59
      4.1.1.2 试剂  59-60
      4.1.1.3 主要设备  60
    4.1.2 实验方法  60-62
      4.1.2.1 菌株活化与培养  60
      4.1.2.2 菌体生物量的测定  60
      4.1.2.3 IPTG浓度对蛋白表达的影响研究  60
      4.1.2.4 诱导温度对蛋白表达的影响研究  60-61
      4.1.2.5 不同的菌体生长程度对蛋白表达的影响  61
      4.1.2.6 蛋白表达的测定  61
      4.1.2.7 蛋白含量的测定  61
      4.1.2.8 蛋白质分离纯化  61-62
  4.2 结果  62-70
    4.2.1 IPTG浓度对目的蛋白表达的影响  62-63
    4.2.2 不同菌体生长阶段对目的蛋白表达的影响  63-65
    4.2.3 诱导温度对目的蛋白表达的影响  65-66
    4.2.4 酯酶XL15目标蛋白的分离与纯化  66
    4.2.5 对酯酶XL15进行结构上的对比与分析  66-70
  4.3 讨论  70-71
  4.4 结论  71-72
5. 通过定向进化提高酯酶立体选择性的研究  72-84
  5.1 材料与方法  72-76
    5.1.1 材料  72-73
      5.1.1.1 菌株和质粒  72
      5.1.1.2 工具酶  72-73
      5.1.1.3 试剂  73
      5.1.1.4 主要设备  73
    5.1.2 实验方法  73-76
      5.1.2.1 易错PCR与突变文库的构建  73-74
      5.1.2.2 RSP_2728酯酶突变体的诱导表达  74
      5.1.2.3 阳性克隆手性选择性的初筛  74-75
      5.1.2.4 阳性克隆手性选择性的复筛  75
      5.1.2.5 蛋白质含量测定  75
      5.1.2.6 分析方法  75-76
  5.2 结果  76-83
    5.2.1 易错PCR条件的确定  76-77
    5.2.2 突变体文库的构建  77
    5.2.3 突变体的筛选与鉴定  77-79
      5.2.3.1 突变体的高通量筛选模型  77-78
      5.2.3.2 突变体初筛与复筛结果  78-79
    5.2.4 活性与立体选择性的进化过程  79-80
    5.2.5 活性与立体选择性的进化过程  80-81
    5.2.6 突变基因的序列分析  81-83
  5.3 讨论  83
  5.4 结论  83-84
6. 结论与展望  84-87
  6.1 结论  84-85
  6.2 展望  85-87
参考文献  87-92
附录  92-94

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学(生物技术) > 酶工程
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