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鸭瘟病毒US4基因的原核表达及应用

作　者: 杨晓圆
导　师: 汪铭书；程安春
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭瘟病毒 US4基因 分子特性分析 克隆表达 ELISA 细胞定位 表达时相
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本论文对DPV US4基因进行了分子特性分析,并将该基因进行克隆、原核表达以及利用表达蛋白制备多克隆抗体；此外,建立了基于US4截段基因表达重组蛋白作为抗原的间接ELISA方法以检测鸭瘟病毒抗体,并利用免疫荧光的方法对US4基因产物在DPV感染宿主细胞中的定位和表达时相进行了分析,结果如下：1.鸭瘟病毒US4基因分子特性分析DPV US4基因全长1380bp,编码一条由459个氨基酸残基组成的多肽。序列比对结果发现,DPV US4蛋白(gG)与α-疱疹病毒gG蛋白的氨基酸序列有较高的同源性,通过进化树的分析,结果显示DPV分为单独的一支,并与α-疱疹病毒亚科中传染性喉气管炎病毒属的GaHV-1和PsHV-1具有较近的亲缘关系,揭示α-疱疹病毒亚科中,DPV-CHv应被划为单独的一类。DPV gG推导肽链包含许多膜蛋白的特征,包括含有一个N端信号肽序列,2个跨膜区以及9个N端糖基化位点,进一步的分析显示,其属于Ⅰ型跨膜蛋白；蛋白亚细胞定位的分析表明,该蛋白分别定位于高尔基体、内质网和细胞膜；蛋白二级结构及抗原表位预测结果表明,DPVgG具有良好的抗原性。2.鸭瘟病毒US4基因的原核表达及多克隆抗体的制备通过T克隆及双酶切,将US4基因插入pET-32a(+)从而构建重组表达质粒pET-32a(+)/US4.将重组表达质粒pET-32a(+)/US4转化至表达宿主菌,IPTG进行诱导后,得到的表达蛋白经检测大小与理论值相符。IPTG浓度为1.0 mmol/L,25℃诱导过夜时可获得最佳表达效果,表达的重组融合蛋白主要以包涵体形式存在。运用亲和层析方法对表达蛋白进行纯化,并用纯化后的蛋白免疫家兔制备兔抗gG高免血清。通过Western-blot检测,US4重组蛋白能作为抗原被鸭抗DPV全病毒血清识别,具有较好的反应原性,同时,制备的抗兔gG血清具有较高的特异性,可用其对DPV US4基因产物进行更深入的研究。3.鸭瘟病毒US4截段基因表达重组蛋白作为抗原建立间接ELISA检测鸭瘟病毒抗体根据DPV US4基因的生物信息学分析结果,选取其编码蛋白的主要抗原域(68aa-377aa)并命名为US4M,然后对该截段蛋白进行了原核表达。表达结果说明US4截段重组蛋白在耗时少,耗材少的情况下能够更加高效地表达。通过Western-blot试验,证实高效表达的US4截段重组蛋白具有良好的反应原性,在此基础上,本研究建立了基于DPV US4截段基因表达重组蛋白的间接ELISA方法,以检测鸭瘟病毒抗体。实验结果显示,抗原最佳包被浓度为2.5ug/100μl,可以检测到的DPV阳性血清稀释倍数为1：1280,具有较好的敏感性；批内、批间实验结果显示,利用该截段重组蛋白建立的间接ELISA方法具有较好的重复性,同时,通过特异性实验证实该法具有较好的特异性,可以用于鸭瘟病毒抗体检测。4.鸭瘟病毒体外感染鸭胚成纤维细胞US4基因产物的细胞定位及表达时相分析加入ACV和未加入ACV对感染细胞特异性荧光的出现没有影响,说明DPV US4基因的表达不依赖于病毒DNA的合成,其转录受早期启动子的调控,是一个早期基因；固定并透化的DEF在接种DPV CHv强毒4h检测到细胞质中特异性点状绿色荧光,且该特异性荧光随病毒感染时间的延长而增加,只固定的DEF最早在接种DPV CHv强毒8h检测到细胞膜上特异性绿色荧光。

全文目录


中文摘要  4-5
ABSTRACT  5-7
缩略词表  7-9
目录  9-14
第一部分 文献综述及选题目的和意义  14-17
  第一章 疱疹病毒US4基因及其编码蛋白的研究进展  14-17
    1. 疱疹病毒US4基因及其编码蛋白研究进展  14-16
      1.1 疱疹病毒US4基因及其编码蛋白的特点  14
      1.2 US4编码蛋白的作用  14-15
        1.2.1 影响趋化因子活性  14
        1.2.2 US4编码蛋白在调理细胞方面的作用  14-15
      1.3 US4编码蛋白与其它蛋白的相互作用  15
        1.3.1 US4编码蛋白与US3蛋白的相互作用  15
        1.3.2 US4编码蛋白与US8蛋白(gE)的相互作用  15
      1.4 展望  15-16
    2. 选题目的和意义  16-17
第二部分 试验研究  17-54
  第二章 鸭瘟病毒US4基因的克隆及分子特性分析  17-26
    1. 材料  17
      1.1 病毒、载体及细胞  17
      1.2 试剂  17
    2. 方法  17-18
      2.1 US4基因  17
      2.2 US4基因的克隆和测序  17-18
      2.3 US4基因编码蛋白的生物信息学分析  18
    3. 结果  18-23
      3.1 DPV US4基因的克隆和测序  18
      3.2 US4基因编码蛋白的序列比对  18
      3.3 US4基因编码蛋白的分子特性分析  18-23
        3.3.1 氨基酸组成分析  18-20
        3.3.2 抗原位点预测  20
        3.3.3 二级结构与三级结构预测  20-22
        3.3.4 DPVgG的物理化学性质  22-23
    4. 讨论  23-26
      4.1 进化关系分析  24
      4.2 序列的分子特性与功能预测  24-26
  第三章 鸭瘟病毒US4基因的原核表达及多克隆抗体的制备  26-38
    1. 材料  26-27
      1.1 毒株、载体和细胞  26
      1.2 试验动物  26
      1.3 主要药品与试剂  26
      1.4 主要试剂的配制  26
      1.5 试验仪器  26-27
    2. 方法  27-30
      2.1 DNA模板的制备  27
        2.1.1 鸭胚成纤维细胞(DEF)的制备  27
        2.1.2 鸭瘟病毒的培养及病毒DNA的提取  27
      2.2 重组表达质粒pET-32a(+)/Us4的构建  27-28
        2.2.1 质粒DNA抽提  27
        2.2.2 目的基因和表达载体的双酶切  27
        2.2.3 连接  27
        2.2.4 连接载体转化感受态细胞  27-28
        2.2.5 转化菌落的鉴定和筛选  28
      2.3 目的蛋白的诱导表达及鉴定  28-29
        2.3.1 目的蛋白的诱导表达  28
        2.3.2 表达产物的SDS-PAGE鉴定  28
        2.3.3 表达条件的优化  28-29
      2.4 抗原的制备  29
        2.4.1 目的蛋白的大量诱导表达  29
        2.4.2 目的蛋白的纯化  29
      2.5 高免血清的制备  29-30
        2.5.1 抗原的准备及检查  29
        2.5.2 抗原的免疫及高免血清的制备  29-30
        2.5.3 琼扩实验测定抗体效价  30
        2.5.4 兔抗DPVgG高免血清中IgG的提取  30
        2.5.5 抗体纯化及纯度鉴定  30
      2.6 Western-blot  30
        2.6.1 表达的融合蛋白的鉴定  30
        2.6.2 DPVgG抗血清特异性检测  30
    3. 结果  30-36
      3.1 重组表达质粒pET-32a(+)/US4的构建  30
      3.2 US4基因的表达及表达形式分析  30-32
      3.3 表达条件的优化  32-33
        3.3.1 IPTG浓度的优化  32
        3.3.2 诱导温度条件的优化  32-33
        3.3.3 诱导时间的优化  33
      3.4 表达蛋白的纯化  33-34
      3.5 琼扩实验测定抗体效价  34
      3.6 兔抗gG IgG的纯化及SDS-PAGE鉴定  34-35
      3.7 Western-blot检测  35-36
        3.7.1 表达的融合蛋白的鉴定  35-36
        3.7.2 抗体特异性检测  36
    4. 讨论  36-38
  第四章 鸭瘟病毒US4截段基因原核表达及表达蛋白作为抗原建立间接ELISA检测鸭瘟病毒抗体  38-50
    1. 材料  38-39
      1.1 原核表达及抗原性分析  38
      1.2 血清  38
      1.3 ELISA相关溶液  38
      1.4 主要试剂  38
      1.5 主要仪器  38-39
    2. 方法  39-41
      2.1 引物设计  39
      2.2 PCR扩增DPV US4截段基因  39
      2.3 DPV US4截段基因重组表达质粒pET-32a(+)/US4M的构建  39
      2.4 目的蛋白的诱导表达  39-40
      2.5 Western-blot检测截段重组蛋白抗原性  40
      2.6 截段重组蛋白作为抗原建立间接ELISA检测鸭瘟病毒抗体  40-41
        2.6.1 抗原最佳包被浓度及抗体最适稀释倍数的确定  40
        2.6.2 酶标抗体最佳工作浓度测定  40
        2.6.3 阴阳性临界值判定标准的确定  40
        2.6.4 特异性试验  40
        2.6.5 稳定试验  40
        2.6.6 敏感性试验  40-41
    3. 结果  41-48
      3.1 DPV US4截段基因的的扩增、T-克隆与鉴定结果  41
        3.1.1 US4截段基因的PCR扩增结果  41
        3.1.2 US4截段基因T克隆鉴定结果  41
      3.2 DPV US4截段基因重组表达质粒pET-32a(+)/US4M的构建  41-42
        3.2.1 重组表达质粒pET32a(+)/US4M的构建与酶切鉴定  41-42
      3.3 重组质粒pET-32a(+)/US4M的诱导表达及表达形式分析  42-43
      3.4 重组质粒pET32a(+)/US4M表达条件的优化  43-45
        3.4.1 IPTG浓度的优化  43
        3.4.2 诱导温度条件的优化  43
        3.4.3 诱导时间的优化  43-45
      3.5 重组表达蛋白的纯化  45
      3.6 截段重组蛋白抗原性  45-46
      3.7 截段重组蛋白作为抗原建立间接ELISA检测鸭瘟病毒抗体  46-48
        3.7.1 抗原最佳包被浓度和血清最适稀释倍数的确定  46
        3.7.2 酶标抗体最适浓度的确定  46-47
        3.7.3 阴阳性临界值判定标准的确定  47
        3.7.4 特异性试验  47
        3.7.5 稳定试验  47-48
        3.7.6 敏感性试验  48
    4. 讨论  48-50
  第五章 鸭瘟病毒US4基因产物在感染细胞中的定位及表达时相研究  50-54
    1. 材料  50
      1.1 毒株和细胞  50
      1.2 主要试剂及配制方法  50
      1.3 主要仪器设备  50
    2. 实验方法  50-51
      2.1 间接免疫荧光检测DPV US4在感染细胞中的定位及表达时相  50-51
        2.1.1 间接免疫荧光方法的建立  50
        2.1.2 间接免疫荧光检测方法条件的优化  50
        2.1.3 结果判定标准  50-51
      2.2 DPV US4基因产物在感染细胞中的定位及表达时相研究  51
      2.3 DPV US4基因产物的表达是否依赖于病毒DNA合成的检测  51
    3. 结果  51
      3.1 优化条件结果  51
      3.2 DPV US4基因产物的亚细胞定位及表达时相分析  51
    4. 讨论  51-54
结论  54-55
参考文献  55-59
致谢  59-60
作者简介以及攻读硕士学位期间发表的学术论文  60

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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