学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

醋酸杆菌催化手性醇的不对称合成及其反-Prelog羰基还原酶的酶学特性研究

作　者: 陈晓红
导　师: 宗敏华
学　校: 华南理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 醋酸杆菌 不对称还原反应 手性醇 固定化 羰基还原酶
分类号: Q814
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 44次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


光学纯的手性醇及其衍生物是合成手性药物、农药及功能材料的重要中间体，其中对映体纯的芳香醇类是合成多种治疗神经系统和心血管疾病药物以及抗炎药物、抗过敏药物的手性砌块；光学纯脂肪醇类如R型或S型的2-辛醇是合成手性液晶材料、类固醇、昆虫性外激素等的重要手性前体物质。目前，采用酶或微生物细胞催化手性醇合成的生物催化法受到广泛的关注。本课题组从“中华开菲尔”菌粒中成功筛选得到一株新型醋酸杆菌Acetobacter sp.CCTCC M209061，该菌能遵循反-Prelog规则催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮（TMSBO）高效、高选择性的不对称还原合成对映体纯的(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇[(R)-TMSBL]。前述研究采用番茄汁培养基培养该新菌株，生物量较低，细胞的还原活性及稳定性也不甚理想，这限制了该新型菌株的工业化应用。因此，本文首先考察了培养基组成及培养条件对醋酸杆菌Acetobacter sp. CCTCC M209061的生长及催化活性的影响，提高了该菌株的生物量及还原活性；随后将该活性细胞固定化，获得了稳定性好、重复性佳且催化活性高的固定化Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞；同时探讨了不同反应介质对固定化细胞催化(R)-2-辛醇不对称合成的影响规律，建立可广泛用于高效合成对映体纯手性醇的生物催化体系；并分离纯化得到在不对称还原反应中起关键作用的反-Prelog羰基还原酶，系统研究了其酶学特性，为该酶的进一步研究及实际应用奠定基础。结合单因素实验方法和响应面分析方法（中心组合旋转设计）考察了培养基组成和培养条件对醋酸杆菌Acetobacter sp. CCTCC M209061的生长及还原活性的影响，优化后的培养基组成和培养条件分别为：葡萄糖8.3g/L，果糖2.5g/L，大豆蛋白胨83.9g/L，MnSO4·H2O0.088g/L，初始pH值为5.7，培养温度30℃，摇床转速为80r/min，接种量为10%（v/v）。在此条件下培养30h后，所得生物量达1.10g/L，为初始条件下的9.5倍，细胞催化4’-氯苯乙酮不对称还原为(R)-1-(4-氯苯基)乙醇的比活由29.34μmol/min/g提高到39.49μmol/min/g，产物的e.e.值为99%以上。此外，优化培养所得的Acetobactersp. CCTCC M209061细胞催化TMSBO不对称还原为药物中间体(R)-TMSBL的催化效率也得到了提高。尽管优化培养所得的Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞具有较好的催化活性，但其稳定性和重复利用性相对其他生物催化剂而言仍然较差。因此，考察了不同固定化方法对醋酸杆菌细胞操作稳定性的影响。研究发现，海藻酸钙包埋的Acetobacter sp.CCTCC M209061细胞具有较好的催化活性，利用壳聚糖覆膜可进一步提高其机械强度和抗溶胀性能。以催化4’-氯苯乙酮不对称还原的活性及重复批次为标准，确定最优的固定化条件为：海藻酸钠2.5%（w/v），CaCl20.2mol/L，壳聚糖0.9%（w/v），壳聚糖溶液的pH值5.0，覆膜时间20min，细胞载量为每克湿固定化颗粒中含细胞干重17.2mg。在此条件下制备的固定化Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞的活性为等量游离细胞活性的85%，其热稳定性、pH稳定性、溶剂耐受性以及贮藏稳定性相对游离细胞均有所提高，连续反应25批后，其催化活性保持50%以上，是游离细胞重复批次的3.5倍（7批次）。反应25批次后的固定化细胞在新鲜培养基中复活培养24h后，可再重复反应25批次。在反应体系中，达姆科勒系数Da﹤﹤1，说明外部传质阻力可忽略；效率因子i﹤1和蒂勒模数0.3﹤﹤1，表明内部传质阻力对催化反应有一定影响但并非主要限制性因素。海藻酸钙包埋壳聚糖覆膜有效地固定Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞，提高其重复利用性。随后考察了不同反应介质中固定化Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化2-辛酮的不对称还原反应，进一步扩展其在手性醇合成中的应用。在水相反应体系中，该反应的最适pH值、反应温度、辅底物、辅底物浓度、底物浓度和振荡速度分别为5.5、35℃、葡萄糖、100mmol/L、6mmol/L、200r/min。在上述反应条件下，固定化醋酸杆菌细胞（0.3g/mL）催化2-辛酮不对称还原反应的初速度、最大产率及产物的e.e.值分别为0.393mmol/L/min，99.0%和97.3%。在水相反应体系中，因底物溶解度低，底物及产物抑制严重，故反应效率较低。为此，探讨了向水相缓冲液体系中添加亲水性离子液体对该反应的影响。研究发现，添加[C4MIM]·Ac有利于增加细胞膜的通透性，降低胞内产物浓度，提高反应效率。最适[C4MIM]·Ac浓度为3%（m/v），最适底物浓度、反应初速度和产物的e.e.值均高于水相体系的对应值，分别为10mmol/L、0.558mmol/L/min和99.3%。为进一步提高反应效率，在含[C4MIM]·Ac缓冲液体系中引入正十四烷第二相，以有效萃取2-辛酮和2-辛醇，控制水相中的底物和产物浓度处于较低水平，减轻底物和产物抑制。最适两相体积比（Vaq/Vor）和底物浓度分别为3:1和500mmol/L，产率为53.4%，产物浓度可达267mmol/L，产物的e.e.值﹥99%。可见含[C4MIM]·Ac缓冲液/正十四烷双相反应体系显著提高了该反应的效率。在Acetobacter sp. CCTCC M209061全细胞催化羰基化合物高选择性不对称还原的过程中，起关键催化作用的是细胞内的反-Prelog羰基还原酶（AcCR），本研究通过4步将之分离纯化，总酶活得率为0.4%，纯化倍数为27.5倍，比活力为3.85U/mg。该酶的表观分子量为104kDa，亚基分子量为27kDa，是同源四聚体结构，含有四个相同亚基。AcCR能催化羰基的还原和对应醇的氧化，NAD(H)和NADP(H)均可作为其辅酶。该酶以NADH为辅酶催化4’-氯苯乙酮不对称还原时，最适pH值为5.0，最适温度为25℃，与全细胞催化反应的最适条件相似；而以NADPH为辅酶时，最适pH值为7.5，最适温度为25℃。在催化异丙醇的氧化时，以NAD+或NADP+为辅酶时AcCR表现出相似的催化特性，最适pH值和最适温度相同，分别为8.0和35℃。Mn2+，Ni2+和Fe2+对AcCR具有显著的激活作用，Zn2+和Ca2+次之，Co2+和Mg2+也有一定的激活作用。Hg2+和Ag+对该酶的活性有显著的抑制作用，Cu2+次之。碘乙酰胺和β-巯基乙醇对AcCR的活性影响较小，5mmol/L的EDTA完全抑制了该酶的活力。此外，该酶可催化多种羰基化合物如芳香酮类、脂肪酮类、α-酮酯类的高效、高选择性不对称还原。对AcCR催化4’-氯苯乙酮不对称还原反应的动力学研究发现，AcCR对NADH的Km值是对NADPH的Km值的25倍（0.66mmol/L vs0.026mmol/L），说明该酶对NADPH的亲和力远远高于对NADH的亲和力。当NADH作为辅酶时，反应的初速度随底物4’-氯苯乙酮浓度的变化曲线呈S型，符合Hill模型，所得Hill系数为3.1，表明四个亚基的底物结合位点之间存在相互协同作用，反应的Vmax值稍高于NADPH为辅酶时的Vmax值（0.21mmol/L/min vs0.17mmol/L/min）。同样研究了AcCR催化异丙醇氧化反应的动力学性质，以NAD+为辅酶时，Km和Vmax值分别为1.33mmol/L（NAD+），48.32mmol/L（异丙醇），0.069mmol/L/min；以NADP+为辅酶时，Km和Vmax值分别为1.12mmol/L（NADP+），67.82mmol/L（异丙醇），0.074mmol/L/min。本研究不仅有助于丰富对生物催化和生物转化的认识，还提供了高效、高选择性制备对映体纯手性醇的新途径。

全文目录


摘要  5-8
ABSTRACT  8-12
目录  12-17
第一章 绪论  17-28
  1.1 手性化合物及手性醇  17-18
    1.1.1 手性化合物的应用  17
    1.1.2 手性醇的制备  17-18
  1.2 微生物细胞在生物催化手性醇合成中的应用  18-21
    1.2.1 催化手性醇合成的微生物细胞的来源  19-20
    1.2.2 微生物细胞的固定化  20-21
  1.3 非传统介质体系中微生物细胞催化羰基化合物的不对称还原反应  21-24
    1.3.1 有机溶剂单相体系  21
    1.3.2 水/有机溶剂双相体系  21-22
    1.3.3 含亲水性离子液体单相体系  22-23
    1.3.4 水/离子液体双相体系  23
    1.3.5 超临界流体反应体系  23-24
  1.4 羰基还原酶简介  24-26
    1.4.1 辅酶依赖性  24-25
    1.4.2 立体选择性催化  25
    1.4.3 羰基还原酶的底物特异性  25-26
  1.5 本研究的主要内容及意义  26-28
    1.5.1 研究的主要内容  26-27
    1.5.2 研究的主要意义  27-28
第二章 培养基组成及培养条件对Acetobacter sp. CCTCC M209061 的生长及还原活性的影响  28-52
  2.1 实验材料  29
    2.1.1 菌种与培养基  29
    2.1.2 主要试剂  29
  2.2 主要实验仪器  29-30
  2.3 实验方法  30-34
    2.3.1 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞的培养  30
    2.3.2 单因素实验  30-31
    2.3.3 响应面分析实验  31
    2.3.4 培养基比较  31
    2.3.5 生物量测定  31-32
    2.3.6 残糖含量测定  32
    2.3.7 还原活性检测  32
    2.3.8 气相色谱分析  32-33
    2.3.9 原子吸收光谱分析  33
    2.3.10 产物立体选择性分析  33
    2.3.11 反应初速度、产率和产物对映体纯度的确定  33-34
  2.4 结果与讨论  34-50
    2.4.1 单因素实验  34-43
    2.4.2 响应面法优化  43-48
    2.4.3 培养基比较  48-49
    2.4.4 优化培养所得 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞立体选择性还原TMSBO  49-50
  2.5 本章小结  50-52
第三章 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞的固定化  52-74
  3.1 实验材料  52
    3.1.1 菌种与培养基  52
    3.1.2 主要试剂  52
  3.2 主要实验仪器  52
  3.3 实验方法  52-56
    3.3.1 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞的培养  52-53
    3.3.2 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞的固定化  53-54
    3.3.3 固定化 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞的机械强度  54
    3.3.4 固定化 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞的粒径  54
    3.3.5 固定化 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞的还原活性  54
    3.3.6 固定化 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞的稳定性  54-55
    3.3.7 扫描电子显微镜观察  55
    3.3.8 传质实验  55
    3.3.9 气相色谱分析  55
    3.3.10 数据处理方法  55-56
  3.4 结果与讨论  56-73
    3.4.1 游离 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞批次催化 4'-氯苯乙酮不对称还原反应的研究  56-57
    3.4.2 固定化材料的选择  57-59
    3.4.3 复合固定化方法优化  59-63
    3.4.4 固定化 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞的稳定性  63-66
    3.4.5 固定化 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞的批次重复实验  66-67
    3.4.6 传质实验结果  67-71
    3.4.7 扫描电子显微镜观察  71-73
  3.5 本章小结  73-74
第四章 固定化 Acetobacter sp CCTCC M209061 细胞的应用  74-102
  4.1 实验材料  75-76
    4.1.1 菌种与培养基  75
    4.1.2 主要试剂  75-76
  4.2 主要实验仪器  76
  4.3 实验方法  76-81
    4.3.1 Acetobacter sp CCTCC M209061 细胞的培养  76
    4.3.2 Acetobacter sp CCTCC M209061 细胞的固定化  76
    4.3.3 缓冲液体系中固定化 Acetobacter sp CCTCC M209061 细胞催化 2-辛酮不对称还原反应的研究  76-78
    4.3.4 含离子液体缓冲液体系中固定化 Acetobacter sp CCTCC M209061 细胞催化 2-辛酮不对称还原反应的研究  78-79
    4.3.5 含[C4MIM]·Ac 缓冲液/有机溶剂双相体系中固定化 Acetobacter sp CCTCC M209061 细胞催化 2-辛酮不对称还原反应的研究  79-80
    4.3.6 气相色谱分析  80-81
  4.4 结果与讨论  81-100
    4.4.1 缓冲液体系中固定化 Acetobacter sp CCTCC M209061 细胞催化 2-辛酮不对称还原反应的研究  81-90
    4.4.2 含离子液体缓冲液体系中固定化 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞催化 2-辛酮不对称还原反应的研究  90-95
    4.4.3 含[C4MIM]·Ac 缓冲液/有机溶剂双相体系中固定化 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞催化 2-辛酮不对称还原反应的研究  95-99
    4.4.4 固定化 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞在不同反应体系中催化 2-辛酮不对称还原反应的比较  99-100
  4.5 本章小结  100-102
第五章 Acetobacter sp. CCTCC M209061 细胞中反-Prelog 羰基还原酶的分离纯化和酶学性质研究  102-132
  5.1 实验材料  102-103
    5.1.1 菌种与培养基  102
    5.1.2 主要试剂  102-103
  5.2 主要实验仪器  103
  5.3 实验方法  103-109
    5.3.1 羰基还原酶 AcCR 的分离纯化  103-104
    5.3.2 羰基还原酶 AcCR 的分子量测定  104-105
    5.3.3 酶活及蛋白含量的测定  105-106
    5.3.4 AcCR 的最适反应温度及热稳定性  106
    5.3.5 AcCR 的最适反应 pH 值及 pH 稳定性  106
    5.3.6 不同试剂对 AcCR 催化活性的影响  106
    5.3.7 AcCR 的底物特异性  106-107
    5.3.8 AcCR 催化 4'-氯苯乙酮还原反应和异丙醇氧化反应的动力学参数测定 ..  107
    5.3.9 辅酶供给方式对 AcCR 还原活性的影响  107-109
    5.3.10 气相色谱分析  109
  5.4 结果与讨论  109-130
    5.4.1 超声破碎时间对酶活的影响  109-110
    5.4.2 羰基还原酶在细胞内的定位及其辅酶依赖性  110-111
    5.4.3 细胞培养时间对羰基还原酶活性及贮藏稳定性的影响  111
    5.4.4 硫酸铵沉淀  111-112
    5.4.5 DEAE-Sepharose 阴离子交换层析  112-113
    5.4.6 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  113-114
    5.4.7 羰基还原酶的纯化结果  114
    5.4.8 酶蛋白分子量的确定  114-115
    5.4.9 AcCR 催化反应的可逆性及辅酶依赖性  115-116
    5.4.10 AcCR 的最适催化温度及热稳定性  116-118
    5.4.11 AcCR 催化反应的最适 pH 及 pH 稳定性  118-120
    5.4.12 AcCR 的贮藏稳定性  120-121
    5.4.13 化学试剂对 AcCR 催化活性的影响  121-123
    5.4.14 AcCR 的底物选择性  123
    5.4.15 AcCR 的动力学性质  123-128
    5.4.16 辅酶供给方式对 AcCR 还原活性的影响  128-130
  5.5 本章小结  130-132
结论和展望  132-136
参考文献  136-151
附录一 GC 色谱图  151-158
附录二 缩写  158-160
攻读博士学位期间取得的研究成果  160-162
致谢  162-163
答辩委员会对论文的评定意见  163

相似论文

  1. 扩展青霉TS414脂肪酶在毕赤酵母的表达、纯化及其催化外消旋萘普生酯化拆分的研究,Q814
  2. β-半乳糖苷酶固定化及低乳糖奶制备技术的研究,TS252.4
  3. 固定化黄孢原毛平革菌—活性污泥联合处理硝基苯废水的研究,X703
  4. 嗜热菌几丁质结合域及其在酶固定化中应用的研究,Q814
  5. 草除灵高效降解菌的分离鉴定、降解特性及降解途径的研究,X172
  6. 脂肪酶催化猪油合成L-抗坏血酸脂肪酸酯,TS221
  7. 洋葱假单胞菌S31脂肪酶的分离提取及其在食品中应用,TS201.25
  8. 葛根素微生物糖基化作用小试及固定化酶研究,R284.1
  9. 甲醛降解菌筛选、关键酶基因克隆表达和固定化细胞降解特性的研究,X172
  10. 壳聚糖磁性微球的制备及其在酶固定化中的应用,O631.3
  11. 磁性纳米颗粒固定化酶研究,Q814.2
  12. 磁性载体在固定化酶及连续式生物反应器中的应用研究,TQ033
  13. 反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究,X172
  14. 壬基酚降解酶的特性研究,X172
  15. 野油菜黄单胞杆菌纤维素酶基因原核表达及其固定化研究,Q93
  16. Fe3O4/SiO2磁性载体固定化漆酶降解甲基橙,X703
  17. 含糖聚合物纳米纤维膜的制备及其在酶固定化中的应用,TB383.2
  18. 酵母醇脱氢酶的提纯及应用研究,TQ464.8
  19. 羰基还原酶的基因挖掘与催化性能研究,Q814
  20. 固定化复合微生物技术处理梁滩河水体的研究,X172
  21. 手性二元醇及α-氨基酸焓对相互作用的溶剂效应,O621.25

中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
© 2012 www.xueweilunwen.com