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羰基还原酶的基因挖掘与催化性能研究

作　者: 王丽娟
导　师: 许建和
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 羰基还原酶基因挖掘天蓝色链霉菌A3(2) 不对称还原 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯手性醇底物偶联 NADH再生
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

光学活性手性醇是一种重要的手性合成子,广泛应用于医药、农药、香精香料、食品添加剂、液晶等高附加值精细化学品合成中。生物催化潜手性羰基化合物的不对称还原,由于具有反应条件温和、转化率高和选择性高等优点,已成为获取光学活性手性醇的有效途径之一。本研究采用基因挖掘的方法,获得一种来源于天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolorA3(2)的NADH依赖型的羰基还原酶ScCR1。对该酶进行了纯化和酶学性质的研究,其最适反应pH为6.5,最适反应温度为45℃,该酶在30、40℃下较稳定,在50℃下活力迅速下降；Mg2+对ScCR1酶活有较强的促进作用,乙醇对该酶的毒性较小。该酶对COBE的Km为0.49 mM,其相应的Vmax为43.7μmol·min-1·mg-1;对异丙醇的Km为153 mM,其相应的Vmax为34.4μmol·min-1·mg-1。ScCR1的底物谱非常广泛,对芳基酮、α-酮酯和β-酮酯都具有良好的催化作用,特别是对p-酮酯显示了高催化活力和高选择性(>99%ee),且该酶能催化大多数底物生成anti-Prelog构型的手性醇。本研究对高浓度的4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)进行了催化还原,在100 mL水/甲苯(1：1,v/v)两相体系中,在1.8底物当量的异丙醇和0.3 mM NAD+存在下,加入30g(600g/L)的底物和20 gDCW/L的重组菌体,可使反应转化率达到99%,ee值达99%以上,分离得率为93%,TTN为12,100。这些结果充分显示了ScCR1在手性醇合成中的工业应用潜力。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第1章文献综述  10-22
  1.1 手性化合物简介  10-11
  1.2 手性醇的用途  11
  1.3 手性醇的制备方法  11-14
    1.3.1 化学法  11-13
    1.3.2 生物催化法  13-14
      1.3.2.1 生物法动力学拆分  13-14
      1.3.2.2 生物法不对称还原  14
  1.4 生物法不对称合成手性醇的研究现状  14-20
    1.4.1 生物法不对称还原的机理  14-15
    1.4.2 辅酶再生  15-16
    1.4.3 羰基还原酶的来源及发现  16-18
    1.4.4 生物催化反应工程  18
    1.4.5 酶法不对称还原在手性药物合成中的应用实例  18-20
  1.5 本课题的研究目的及意义  20
  1.6 本论文的主要研究内容  20-22
第2章羰基还原酶的基因挖掘  22-36
  2.1 引言  22
  2.2 基因挖掘策略  22
  2.3 材料与方法  22-29
    2.3.1 常用试剂和仪器  22-23
    2.3.2 菌株与质粒  23
    2.3.3 培养基  23-24
    2.3.4 分析方法  24-25
      2.3.4.1 酶活测定  24
      2.3.4.2 蛋白含量测定  24
      2.3.4.3 气相色谱(GC)检测法  24-25
    2.3.5 实验方法  25-29
      2.3.5.1 羰基还原酶的基因挖掘  25
      2.3.5.2 基因组DNA的提取  25-26
      2.3.5.3 PCR扩增  26-27
      2.3.5.4 表达载体的构建  27-28
      2.3.5.5 重组羰基还原酶的诱导表达  28-29
      2.3.5.6 SDS-PAGE电泳  29
      2.3.5.7 羰基还原酶对COBE的不对称还原  29
  2.4 结果和讨论  29-35
    2.4.1 羰基还原酶的基因挖掘  29-30
    2.4.2 羰基还原酶的克隆表达  30-33
    2.4.3 羰基还原酶的功能筛选  33-35
      2.4.3.1 三种羰基还原酶的底物谱比较  33
      2.4.3.2 三种羰基还原酶对COBE的不对称还原  33-35
  2.5 本章小结  35-36
第3章链霉菌羰基还原酶的酶学性质研究  36-46
  3.1 引言  36
  3.2 材料与方法  36-38
    3.2.1 主要试剂和仪器  36
    3.2.2 分析方法  36
    3.2.3 重组大肠杆菌发酵培养及产酶  36
    3.2.4 重组羰基还原酶ScCR1的纯化  36-37
    3.2.5 羰基还原酶ScCR1的酶学性质研究  37-38
      3.2.5.1 酶的最适反应pH  37
      3.2.5.2 酶的最适反应温度  37
      3.2.5.3 酶的热稳定性  37
      3.2.5.4 金属离子和EDTA对酶活的影响  37
      3.2.5.5 有机溶剂对酶活的影响  37
      3.2.5.6 酶的动力学参数测定  37-38
      3.2.5.7 酶的底物特异性  38
  3.3 结果与讨论  38-45
    3.3.1 重组羰基还原酶ScCR1的纯化  38
    3.3.2 酶的最适反应pH  38-39
    3.3.3 酶的最适反应温度  39-40
    3.3.4 酶的热稳定性  40-41
    3.3.5 金属离子和EDTA对酶活力的影响  41-42
    3.3.6 有机溶剂耐受性  42
    3.3.7 酶的动力学参数测定  42-44
    3.3.8 酶的底物特异性  44-45
  3.4 本章小结  45-46
第4章利用羰基还原酶催化合成手性醇的研究  46-57
  4.1 引言  46
  4.2 材料与方法  46-49
    4.2.1 主要试剂和仪器  46
    4.2.2 分析方法  46-48
    4.2.3 ScCR1酶不对称合成手性醇的底物谱  48
    4.2.4 ScCR1细胞催化合成(S)-CHBE的反应体系优化  48-49
      4.2.4.1 两相体系的选择  48
      4.2.4.2 细胞量的优化  48
      4.2.4.3 NAD~+浓度的优化  48-49
      4.2.4.4 异丙醇浓度的优化  49
  4.3 结果与讨论  49-56
    4.3.1 酶ScCR1不对称合成手性醇的底物谱  49-51
    4.3.2 ScCR1细胞催化合成(S)-CHBE的反应体系优化  51-54
      4.3.2.1 两相体系的选择  51-52
      4.3.2.2 细胞量的优化  52-53
      4.3.2.3 外加辅酶NAD~+浓度的优化  53-54
      4.3.2.4 异丙醇浓度的优化  54
    4.3.3 ScCR1整细胞催化制备(S)-CHBE  54-56
  4.4 本章小结  56-57
结论和展望  57-59
  一、主要结论  57
  二、论文创新点  57-58
  三、今后工作展望  58-59
参考文献  59-66
附录  66-67
硕士在读期间撰写的论文和专利  67-68
致谢  68

羰基还原酶的基因挖掘与催化性能研究

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