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乙醇脱氢酶菌株的选育及其动力学特性研究

作　者: 张云茹
导　师: 霍丹群
学　校: 重庆大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 醋酸杆菌动力学乙醇脱氢酶提取酶学特性
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

乙醇脱氢酶(ADH)是许多有机体中的主要短链醇代谢的关键酶,因其特殊的催化性质引起国内外学者的广泛关注,对ADH的应用研究日益增多。但现有商品ADH多来源于动物肝脏,其资源有限,价格昂贵,因此筛选产高活性ADH的微生物,从中提取ADH,是实现ADH大规模生产的一条重要途径,具有广阔的应用前景。要实现ADH的规模生产,必须首先实现产ADH的菌株的工业化生产,这就需要对产ADH菌株的生长及底物消耗的动力学过程进行充分的认识。目前国内外在这方面的研究较为欠缺。本课题以乙醇为唯一的碳源,筛选出一株可以高效利用乙醇且产ADH的细菌,经鉴定为醋酸杆菌,实验研究了醋酸杆菌Z127的生化反应动力学,并对其中ADH的一些酶学特性进行了探索。这既为醋酸杆菌Z127的连续培养从而实现工业化生产提供了可靠的信息和参数,又为醋酸杆菌ADH的进一步的实验研究和开发利用奠定了基础。本文的主要研究方法、内容及结论如下:1)乙醇脱氢酶菌株的选育及菌属鉴定。在以乙醇为唯一碳源的培养基中培养,用梯度驯化法筛选高效利用乙醇的菌株,并通过形态特征和生理生化实验进行菌属鉴定。结果筛选出一株菌株可以高效利用乙醇的细菌,它可以利用的乙醇浓度范围小于0.6mol/L,乙醇浓度为0.4mol/L时,该菌株生长速率最快。经形态特征和生理生化鉴定,该菌株属于醋酸杆菌属,但其生化特征与醋酸杆菌属中现有的种都不相符,初步判断是一种新的醋酸杆菌,课题中对它命名为Acetobacter Z127。2) Acetobacter Z127的生化反应动力学。以生化反应动力学理论为基础,用Monod模型描述其的生长过程,计算得最大生长比速率um=0.1688,半饱和常数Ks=0.3627;用包括内源代谢的基质消耗动力学模型描述乙醇的消耗过程,得出最大细胞得率=5.6754,维持系数m=0.005。通过实验对模型的检验,表明实验建立的细胞生长动力学模型和乙醇消耗动力学模型可以反映Acetobacter Z127的生长、消耗反应规律。3)Acetobacter Z127中ADH的提取纯化。用4种不同的方法提取ADH,结果发现细菌裂解液提取法对Acetobacter Z127细胞的破碎率较高,而且能够维持较高的ADH活性,较适合Acetobacter Z127中ADH的提取。Acetobacter Z127中的ADH经细菌裂解液粗提、硫酸铵盐析精提、葡聚糖凝胶过滤层析三步处理纯化了5.49倍,酶活收率为48.09%。纯化后的ADH,经SDS-PAGE得到单一均匀的电泳条带,其分子量为28KDa。 <WP=5>4)ADH的部分酶学性质研究。将ADH在不同pH值的缓冲体系保温相同时间测定其活性,得到它的氧化乙醇最适pH值为7.0。在同一缓冲体系中不同温度下对ADH保温,测定酶活性,结果该ADH可以耐高温,最适温度为60℃。金属离子对ADH酶活有一定的影响,K+对ADH有促进作用,二价金属离子对ADH有不同程度的抑制作用,但Zn2+对ADH没有影响;ADH在Fe3+溶液中极不稳定,产生沉淀。

乙醇脱氢酶菌株的选育及其动力学特性研究

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