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葱叶枯匍柄霉（Stemphylium botryosum）交配型基因MAT1-1、MAT1-2敲除载体的构建及遗传转化系统的建立

作　者: 王琪
导　师: 张修国
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 葱叶枯匍柄霉 交配型 原生质体 根癌农杆菌 遗传转化系统
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


匍柄霉（Stemphylium）是丝状真菌中一类重要的真菌类群，在自然界中该属内真菌绝大多数以无性态形式存在，但也有一小部分存在有性生殖阶段。研究发现该属内真菌交配型位点分为三种情况：只有MAT1-1或MAT1-2，或既有MAT1-1又有MAT1-2，且MAT1-1发生倒置后与MAT1-2连接在一起。其独特的交配型结构为研究真菌有性生殖机制及进化趋势提供了良好的材料。葱叶枯匍柄霉（Stemphylium botryosum）作为该属内的代表种，同一菌株内含有MAT1-1和MAT1-2两个交配型基因，且在实验室条件下易诱导产生有性态。为深入研究交配型基因及其他相关基因的功能，本研究分别构建了这两个基因的敲除载体并对敲除转化体系的建立进行了初步的探索。以从CBS（荷兰）菌种标本馆交换获得的标准菌株S. botryosum (CBS122441)为试验材料，现保存在山东农业大学真菌及真菌资源利用研究室，进行了以下内容研究：1.根据已报道的MAT1-1、MAT1-2基因信息，通过Southern杂交分别检测了野生型菌株内两个基因的拷贝数，确定了其敲除的有效性；2.分别扩增了MAT1-1、MAT1-2两基因的侧翼序列，以pBIG3C28a为基础载体构建了MAT1-1基因敲除载体pBIG3C28a-1R-1L及MAT1-2基因敲除载体pBIG3C28a-2R-2L；3.构建了PEG介导的原生质体转化系统：在原生质体的制备与再生中分析了酶种类及浓度、酶解时间、酶解温度、菌龄以及稳渗剂种类等因素的影响，最终得出15mg/mL裂解酶、10mg/mL溶壁酶、10mg/mL蜗牛酶及5mg/mL纤维素酶四种酶组合用0.7mol/L的NaCl作为稳渗剂在30℃下酶解培养36h的菌丝3.5h可制备出足以用于转化的原生质体，采用1mol/L蔗糖作为稳渗剂再生可得到良好的再生效果，并通过PEG介导转化成功；4.构建了根癌农杆菌介导的遗传转化系统：通过对AS浓度、孢子浓度、农杆菌浓度、共培养时间与温度等不同影响因素的分析得出：用300μmol/L AS诱导OD600值0.8的农杆菌等体积侵染105个/mL的孢子悬浮液，在28℃条件下共培养72h可得到良好的转化效果。葱叶枯匍柄霉交配型基因MAT1-1、MAT1-2敲除载体的构建以及两种遗传转化系统的建立，为深入研究交配型基因打下良好基础，并对其他丝状真菌的遗传转化具有重要的借鉴作用。

全文目录


符号说明  4-11
中文摘要  11-13
Abstract  13-15
1 前言  15-34
  1.1 葱叶枯匍柄霉研究进展  15-17
    1.1.1 匍柄霉属研究概述  15-16
    1.1.2 葱叶枯匍柄霉分类地位及生物学特性  16-17
  1.2 真菌有性生殖研究进展  17-23
    1.2.1 有性生殖的优势  17-18
    1.2.2 有性生殖与环境因素  18-19
    1.2.3 有性生殖与交配识别  19-20
    1.2.4 同宗配合与异宗配合  20-21
    1.2.5 真菌性染色体进化  21-22
    1.2.6 单性线粒体遗传生殖与两性线粒体遗传生殖  22
    1.2.7 真菌有性生殖相关基因研究现状  22-23
  1.3 交配型基因研究进展  23-26
    1.3.1 子囊菌交配型基因序列的结构与命名  24
    1.3.2 交配型位点编码产物及功能研究  24-25
    1.3.3 交配型基因基础理论的应用  25-26
      1.3.3.1 在病原真菌致病性进化方面的应用  26
      1.3.3.2 在真菌进化研究中的应用  26
  1.4 匍柄霉交配型基因的研究进展  26-27
    1.4.1 匍柄霉交配型基因的结构  26-27
    1.4.2 匍柄霉交配型基因与生殖方式研究  27
    1.4.3 匍柄霉交配型基因研究的目的和意义  27
  1.5 丝状真菌遗传转化研究进展  27-32
    1.5.1 电击转化法  28
    1.5.2 基因枪转化  28
    1.5.3 PEG 介导的原生质体转化  28-29
      1.5.3.1 PEG 介导的原生质体转化机理  28-29
      1.5.3.2 PEG 介导的原生质体转化特点  29
    1.5.4 农杆菌介导的遗传转化  29-32
      1.5.4.1 农杆菌介导的遗传转化研究背景  29
      1.5.4.2 农杆菌介导的遗传转化机理  29-31
      1.5.4.3 农杆菌介导丝状真菌转化的特点  31-32
  1.6 Southern 杂交技术  32-33
    1.6.1 Southern 杂交技术原理  32
    1.6.2 地高辛随机引物法标记探针的 Southern 杂交技术  32-33
  1.7 实验目的及意义  33-34
2 材料与方法  34-56
  2.1 试验材料  34-38
    2.1.1 试验所用菌株与质粒  34
    2.1.2 常用试剂  34
    2.1.3 仪器  34
    2.1.4 常用培养基的配制  34-35
    2.1.5 常用试剂的配制  35-38
  2.2 试验方法  38-56
    2.2.1 Southern 杂交检测野生型葱叶枯匍柄霉基因组 DNA 中 MAT1-1、MAT1-2基因拷贝数  38-45
      2.2.1.1 基因组 DNA 的提取  38
      2.2.1.2 探针模板的合成  38-40
      2.2.1.3 DIG-DNA 探针的准备  40
      2.2.1.4 准备所需试剂  40-41
      2.2.1.5 定量标记反应效率  41-42
      2.2.1.6 基因组 DNA 的酶切与分离  42-43
      2.2.1.7 转膜前凝胶处理  43
      2.2.1.8 DNA 转膜  43-44
      2.2.1.9 Southern 杂交过程  44
      2.2.1.10 膜的洗涤  44
      2.2.1.11 免疫检测  44-45
    2.2.2 葱叶枯匍柄霉（S. botryosum）交配型基因 MAT1-1、MAT1-2 敲除载体的构建  45-50
      2.2.2.1 MAT1-1 基因和 MAT1-2 基因的左右侧翼序列的获得  46-47
      2.2.2.2 MAT1-1 基因敲除载体 pBIG3C28a-1R-1L 及 MAT1-2 基因敲除载体pBIG3C28a-2R-2L 的构建  47-49
      2.2.2.3 敲除载体转化农杆菌  49-50
    2.2.3 根癌农杆菌介导的葱叶枯匍柄霉遗传转化系统的建立  50-52
      2.2.3.1 抑制葱叶枯匍柄霉野生型生长的潮霉素最佳浓度筛选  50
      2.2.3.2 葱叶枯匍柄霉菌株的诱导产孢及孢子收集  50
      2.2.3.3 根癌农杆菌介导的葱叶枯匍柄霉遗传转化  50-51
      2.2.3.4 农杆菌介导的遗传转化条件对转化效率的影响测定  51-52
    2.2.4 葱叶枯匍柄霉（S. botryosum）原生质体的制备与再生  52-53
      2.2.4.1 葱叶枯匍柄霉原生质体的制备收集以及影响因素的测定  52-53
      2.2.4.2 葱叶枯匍柄霉原生质体的再生及影响因素的分析  53
    2.2.5 PEG 介导的原生质体转化  53-54
    2.2.6 转化子的筛选与鉴定  54-56
      2.2.6.1 转化子的稳定性测定  54
      2.2.6.2 转化子的 PCR 初步鉴定  54-56
3 结果与分析  56-75
  3.1 野生型葱叶枯匍柄霉 MAT1-1、MAT1-2 基因拷贝数的检测  56
  3.2 葱叶枯匍柄霉 MAT1-1、MAT1-2 基因敲除载体的构建  56-60
    3.2.1 MAT1-1 基因左右翼序列的 PCR 扩增鉴定  56-57
    3.2.2 重组克隆质粒 pEASY-T3-1R、pEASY-T3-1L、pEASY-T3-2R 及 pEASY-T3-2L的构建及验证  57
    3.2.3 重组载体 pBIG3C28a-1R 与 pBIG3C28a-1R-1L 的构建  57-59
    3.2.4 重组载体 pBIG3C28a-2R 与 pBIG3C28a-2R-2L 的构建  59-60
  3.3 根癌农杆菌介导的葱叶枯匍柄霉遗传转化系统的建立  60-66
    3.3.1 抑制葱叶枯匍柄霉野生型生长的潮霉素最佳浓度筛选  60-61
    3.3.2 不同转化条件对转化效率的影响  61-65
    3.3.3 根癌农杆菌介导的遗传转化结果  65-66
  3.4 PEG 介导的原生质体转化系统的建立  66-73
    3.4.1 不同条件对原生质体制备的影响  66-70
    3.4.2 不同条件对原生质体再生的影响  70-71
    3.4.3 PEG 介导的原生质体转化  71-73
  3.5 转化子的初步鉴定与筛选  73-75
    3.5.1 转化子的稳定性测定  73
    3.5.2 转化子的 PCR 初步鉴定  73-75
4 结论与讨论  75-78
  4.1 MAT1-1 和 MAT1-2 基因在葱叶枯匍柄霉野生型菌株内基因拷贝数检测  75
  4.2 MAT1-1 和 MAT1-2 基因敲除载体的构建  75
  4.3 根癌农杆菌介导的葱叶枯匍柄霉遗传转化系统的建立  75-76
  4.4 PEG 介导的葱叶枯匍柄霉原生质体转化系统的建立  76-77
  4.5 展望  77-78
参考文献  78-98
附录  98-99
致谢  99-100
攻读硕士期间发表论文情况  100

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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