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龙须菜原生质体制备、融合和再生及孢子融合的研究

作　者: 王钟霞
导　师: 隋正红
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生物工程
关键词: 龙须菜真江蓠原生质体四分孢子果孢子融合再生
分类号: S968.439
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是一种属于红藻门的大型海藻,是重要的经济海藻,是主要的琼胶生产原料,它所产的琼胶被广泛用于食品、医药和生物工程等领域。至今,对龙须菜基础生物学的研究已有了很多成果,阐明了遗传、杂交、品系选育、种群结构等机理;从70年代初开始对龙须菜在生长和琼胶质量等方面也进行了深入的研究;龙须菜的大规模养殖逐渐从原来的北方低温海区(渤海、黄海)扩展到了南方高温海区(东海和南海部分海域)。但是由于目前龙须菜的栽培主要是采用营养繁殖的方式,种质退化仍是面临的问题,最终会阻碍龙须菜产业的发展,因此采用现代生物技术选育生长快、品质优、抗高温的龙须菜新品系仍是一项重要的课题。植物细胞工程技术是人们较为熟知的现代生物技术,为遗传育种提供了有效的手段。本研究即采用了三种植物细胞工程技术对龙须菜展开了研究,主要方法和结论如下:一.原生质体制备与再生技术。龙须菜属于低等藻类,其藻体结构可简单分为基部(固着器)、茎部与尖部三部分,没有真正意义上根、茎、叶的分化,本实验考虑到龙须菜不同部位生理、生化特性的差异,研究不同部位原生质体制备和再生的差异。原生质体的制备采用酶解法,原生质体的再生培养采用MES液体培养基。实验结果显示:龙须菜三个部位的最佳酶解时间、最大产率和原生质体的再生能力是有差异的,茎部的最佳酶解时间最短,产率最高,而尖部的再生率和活力最高,最后只有尖部制备的原生质体再生成植株。本研究对龙须菜原生质体制备和再生差异的研究为龙须菜原生质体的再生提供了重要参考,也为能利用原生质体融合等细胞工程技术进行龙须菜的良种选育提供了基础性研究资料。二.龙须菜细胞融合技术。本研究一是通过原生质体融合获得龙须菜和真江蓠(Gracilaria vermiculophylla)的体细胞杂交物种,二是通过四分孢子融合获得两个物种的远缘杂交物种,这两种手段都是建立在细胞没有细胞壁,即没有融合屏障的前提下进行的。基于孢子融合同样的原理,本研究还进行了两个探索实验,一是将龙须菜的四分孢子(单倍体)与果孢子(二倍体)进行融合,从而获得三倍体孢子;二是将果孢子自融合,以期获得四倍体孢子。研究结果显示:PEG融合液对细胞有很大的毒性作用,原生质体对PEG融合液的耐受性要强于孢子对PEG融合液的耐受性;最后只有龙须菜和真江蓠四分孢子融合后的培养物发育成幼苗,幼苗的颜色呈淡绿褐色,更接近于真江蓠;幼苗中有个别藻株具有生长速度相对较快,分支相对较多的性状,但是否为融合体发育而成的藻株还需后期的染色体计数实验来验证。本研究为获得龙须菜与其他物种的远缘杂交产物提供了多种途径,也为获得龙须菜多倍体的研究提供了一种新思路,从而为能够利用细胞融合等细胞工程技术进行龙须菜的良种选育提供了基础性研究资料。三.龙须菜染色体制片技术。本研究采用卡宝品红染色—压片法进行龙须菜单倍体染色体数目的观察与计数。研究结果显示:龙须菜的细胞呈现多核现象,并且不同细胞内细胞核的个数是不同的,观察范围内最少的有2个,最多的能达到十几个;通过染色体计数,发现单倍体龙须菜的染色体个数集中在15或16条。本研究为能够使用染色体计数方法判断融合体提供了技术支持,同样也为能更好地利用细胞融合等细胞工程技术进行龙须菜的良种选育提供了基础性研究。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
0 前言  13-29
  0.1 龙须菜的研究概述  13-20
    0.1.1 龙须菜的生物学特征  13-16
    0.1.2 龙须菜的经济价值和生态效益  16-18
    0.1.3 龙须菜的理论研究  18-20
  0.2 植物细胞工程技术概述  20-26
    0.2.1 植物细胞工程技术  20-21
    0.2.2 植物原生质体培养及融合技术  21-22
    0.2.3 海藻原生质体培养及融合技术研究进展  22-26
    0.2.4 植物组织培养物染色体制片技术  26
  0.3 本研究的目的和意义  26-29
1 龙须菜不同部位原生质体制备、再生及原生质体融合  29-41
  1.1 引言  29-30
  1.2 实验试剂、药品和实验仪器  30-31
    1.2.1 实验试剂和药品  30-31
    1.2.2 实验仪器  31
  1.3 实验材料与方法  31-34
    1.3.1 海藻的培养和处理  31
    1.3.2 不同部位原生质体的制备  31-32
    1.3.3 不同部位原生质体的再生培养  32-33
    1.3.4 龙须菜与真江蓠的原生质体融合  33-34
  1.4 结果和分析  34-39
    1.4.1 不同部位原生质体制备的结果与分析  34-36
    1.4.2 不同部位原生质体再生的结果与分析  36-37
    1.4.3 龙须菜与真江蓠原生质体融合的结果与分析  37-39
  1.5 讨论  39-41
2 龙须菜与真江蓠孢子融合  41-51
  2.1 引言  41-42
  2.2 实验试剂、药品和实验仪器  42-43
    2.2.1 实验试剂和药品  42
    2.2.2 实验仪器  42-43
  2.3 实验材料与方法  43-45
    2.3.1 海藻的培养和处理  43
    2.3.2 孢子融合的可行性实验  43
    2.3.3 龙须菜与真江蓠的四分孢子融合  43-44
    2.3.4 龙须菜果孢子的自融合及龙须菜四分孢子与果孢子的融合  44
    2.3.5 孢子融合产物的后期培养  44-45
  2.4 结果和分析  45-49
    2.4.1 孢子融合可行性实验的结果与分析  45-47
    2.4.2 不同浓度PEG6000 融合液对孢子的影响  47
    2.4.3 孢子融合产物的后期培养  47-49
  2.5 讨论  49-51
3 细胞染色体数目的观察与计数  51-56
  3.1 引言  51
  3.2 实验试剂、药品和实验仪器  51-52
    3.2.1 实验试剂和药品  51-52
    3.2.2 实验仪器  52
  3.3 实验材料与方法  52-53
    3.3.1 海藻的选择和处理  52
    3.3.2 压片法观察染色体数目  52-53
  3.4 结果和分析  53-55
    3.4.1 压片方法的优化  53-54
    3.4.2 染色体计数  54-55
  3.5 讨论  55-56
参考文献  56-64
致谢  64-65
个人简历  65
论文投递与发表情况  65

龙须菜原生质体制备、融合和再生及孢子融合的研究

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