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扁蓿豆和清水野生紫花苜蓿原生质体分离与培养条件的筛选

作　者: 陶茸
导　师: 师尚礼
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 草业科学
关键词: 豆科牧草 子叶 下胚轴 愈伤组织 原生质体 分离 培养
分类号: S54
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 26次
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内容摘要


以扁蓿豆、清水野生紫花苜蓿的子叶和下胚轴为试验材料,在建立其优质愈伤组织的基础上,研究影响愈伤组织原生质体分离和培养的可能因素。应用正交试验设计研究了不同外源激素2,4-D、6-BA、KT、NAA对扁蓿豆、清水野生紫花苜蓿子叶和下胚轴愈伤组织形成的影响;扁蓿豆的硬实率高,难以发芽,研究了提高扁蓿豆种子发芽率的方法。用酶解法酶解松软、颗粒明显的愈伤组织,研究不同酶液组合、酶解时间、酶液渗透压、愈伤组织继代培养时间及预处理措施对原生质体分离效果的影响。以扁蓿豆子叶愈伤组织酶解出的高产量和高活力的原生质体为培养对象,研究了原生质体密度、培养方法及外源激素对原生质体分裂的影响。结果表明:1.扁蓿豆种子在98%H2SO4溶液中浸泡15 min效果最佳,发芽率最高,达84 %,比对照提高了59 %。2.激素对两种牧草愈伤组织形成的作用效果:在0.5 mg·L-1 2,4-D +1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 NAA+0.25 mg·L-1 KT处理下,两种牧草子叶愈伤组织诱导效果最佳;0.5 mg·L-1 2,4-D + 1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA+0.25 mg·L-1 KT对扁蓿豆下胚轴愈伤组织诱导效果最明显,0.5 mg·L-1 2,4-D +0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 KT适宜于清水野生紫花苜蓿下胚轴愈伤组织的形成。3.扁蓿豆子叶愈伤组织继代培养12-14 d后,酶解时将材料在CPW-10溶液中浸泡1 h,于0.5 mol·L-1甘露醇的渗透压条件下,在2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%崩溃酶的混合酶液中酶解10 h,分离出的原生质体产量最高达13.67×105个·g -1,存活率高达93.3%。4.扁蓿豆下胚轴愈伤组织继代培养10-12 d后,酶解时将材料在25±1℃的黑暗条件下放置24 h,于0.55 mol·L-1甘露醇的渗透压条件下,在2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶的混合酶液中酶解12 h、分离出的原生质体产量最高达3.57×105个·g -1,存活率达74.37%。5.清水野生紫花苜蓿子叶愈伤组织继代培养12-14 d后,酶解时将材料在CPW-10溶液中浸泡1 h,于0.60 mol·L-1甘露醇的渗透压条件下,在2 %纤维素酶+0.5 %果胶酶+0.3 %离析酶+0.3 %半纤维素酶+0.3 %崩溃酶的混合酶液酶解10 h,分离出的原生质体产量最高达14.45×105个·g -1,存活率高达87.33%。6.清水野生紫花苜蓿下胚轴愈伤组织继代培养12 d后,酶解时将材料在4℃、黑暗条件下放置24 h,于0.55 mol·L -1甘露醇的渗透压条件下,在2 %纤维素酶+0.5 %果胶酶+0.3 %崩溃酶的混合酶液酶解10 h,分离出的原生质体产量最高达7.07×105个·g -1,存活率达82.05 %。7.密度为2.5-5×105个·mL-1的原生质体,在MS+KM8P培养基中,附加0.5 mg·L-1 2,4-D、1 mg·L-1 6-BA、1 mg·L-1NAA,用固液培养法,对原生质体的分裂最为有利,分裂率高达61.4%,并最终可获得原生质体再生的愈伤组织。上述结果表明不同材料在最佳培养条件下形成愈伤组织的能力均较高,在最佳酶解条件下也能够分离出产量高且活力强的原生质体。其中扁蓿豆子叶愈伤组织分离出的原生质体细胞经培养发生了多次分裂,并最终获得了原生质体再生愈伤组织。

全文目录


摘要  3-5
SUMMARY  5-12
缩写词(Abbreviation)  12-13
第一章 文献综述  13-25
  1.1 引言  13
  1.2 植物组织培养的研究进展  13-17
    1.2.1 植物组织培养  13-14
    1.2.2 筛选植物组织培养的培养条件  14-16
      1.2.2.1 培养基的筛选  14-15
      1.2.2.2 培养温度的筛选  15
      1.2.2.3 光照、温度及培养瓶气体的筛选  15-16
    1.2.3 外植体的选取  16
    1.2.4 激素配比对组织培养的影响  16-17
      1.2.4.1 激素配比对愈伤组织诱导的影响  16
      1.2.4.2 激素配比对愈伤组织及幼苗分化的影响  16-17
  1.3 植物原生质体分离与培养的研究进展  17-20
    1.3.1 原生质体及其特性  17
    1.3.2 原生质体的分离方法  17-18
      1.3.2.1 酶解法  17-18
      1.3.2.2 机械法  18
    1.3.3 原生质体的纯化  18
    1.3.4 原生质体活力检测  18-19
    1.3.5 原生质体的培养  19-20
      1.3.5.1 原生质体培养方法  19
      1.3.5.2 原生质体培养条件  19-20
    1.3.6 原生质体的分裂和植株再生  20
  1.4 原生质体融合与体细胞杂交技术  20-21
    1.4.1 原生质体融合  20
    1.4.2 体细胞杂交  20-21
  1.5 存在的问题  21-22
    1.5.1 组织培养  21
    1.5.2 原生质体培养  21-22
    1.5.3 原生质体融合  22
  1.6 本论文研究的目的意义、内容及技术路线  22-25
    1.6.1 研究目的意义  22-24
    1.6.2 研究内容  24
    1.6.3 技术路线  24-25
第二章 两种豆科牧草愈伤组织的诱导培养  25-39
  2.1 引言  25-26
  2.2 材料与方法  26-28
    2.2.1 材料  26
      2.2.1.1 培养基  26
      2.2.1.2 主要试剂和仪器  26
    2.2.2 试验方法  26-28
      2.2.2.1 筛选提高扁蓿豆发芽率的方法  26-27
        2.2.2.1.1 处理  26-27
        2.2.2.1.2 置床  27
      2.2.2.2 外植体的获得  27
      2.2.2.3 愈伤组织的诱导  27-28
      2.2.2.4 试验设计  28
      2.2.2.5 数据分析  28
  2.3 结果与分析  28-35
    2.3.1 提高扁蓿豆发芽率方法的筛选  28-32
      2.3.1.1 物理处理  28-29
      2.3.1.2 化学处理  29-32
        2.3.1.2.1 H_2SO_4 溶液对扁蓿豆种子发芽的影响  29-31
        2.3.1.2.2 NaOH 溶液对扁蓿豆种子发芽的影响  31-32
    2.3.2 不同培养基对扁蓿豆愈伤组织诱导的影响  32-34
    2.3.3 不同培养基对清水野生紫花苜蓿愈伤组织诱导的影响  34-35
  2.4 讨论  35-37
    2.4.1 物理处理对扁蓿豆种子发芽的影响  35-36
    2.4.2 化学处理对扁蓿豆种子发芽的影响  36
    2.4.3 不同外植体的再生能力  36
    2.4.4 诱导愈伤组织最适培养基的筛选  36-37
  2.5 小结  37-39
第三章 两种豆科牧草原生质体的分离研究  39-59
  3.1 引言  39
  3.2 材料与方法  39-43
    3.2.1 材料  39
    3.2.2 培养基  39-40
    3.2.3 主要试剂及仪器  40
    3.2.4 试验方法  40-43
      3.2.4.1 适合于原生质体分离的愈伤组织培养过程  40
      3.2.4.2 原生质体的分离和纯化  40
      3.2.4.3 最佳酶种类、浓度组合的选择  40-41
      3.2.4.4 最佳酶解时间，酶液渗透压，继代培养时间及预处理措施的选择  41-42
      3.2.4.5 原生质体产量及活力测定  42
      3.2.4.6 数据处理  42-43
  3.3 结果与分析  43-55
    3.3.1 适合于原生质体分离的愈伤组织细胞系的建立  43
    3.3.2 酶液组合及浓度对原生质体分离的影响  43-45
      3.3.2.1 酶液组合对扁蓿豆原生质体分离的影响  43-44
      3.3.2.2 酶液组合对清水野生紫花苜蓿原生质体分离的影响  44-45
    3.3.3 酶解时间对原生质体分离的影响  45-48
      3.3.3.1 酶解时间对扁蓿豆原生质体分离的影响  46-47
      3.3.3.2 酶解时间对清水野生紫花苜蓿原生质体分离的影响  47-48
    3.3.4 甘露醇浓度对原生质体分离的影响  48-50
      3.3.4.1 甘露醇浓度对扁蓿豆原生质体分离的影响  48-49
      3.3.4.2 甘露醇浓度对清水野生紫花苜蓿原生质体分离的影响  49-50
    3.3.5 不同继代培养时间对原生质体分离的影响  50-53
      3.3.5.1 不同继代培养时间对扁蓿豆原生质体分离的影响  50-52
      3.3.5.2 不同继代培养时间对清水野生紫花苜蓿原生质体分离的影响  52-53
    3.3.6 不同预处理措施对原生质体分离的影响  53-55
      3.3.6.1 不同预处理措施对扁蓿豆原生质体分离的影响  53-54
      3.3.6.2 不同预处理措施对清水野生紫花苜蓿原生质体分离的影  54-55
  3.4 讨论  55-57
    3.4.1 酶解法对原生质体分离的影响  55
    3.4.2 酶解液的组成、浓度、酶解时间及酶液渗透压  55-56
    3.4.3 继代培养时间及预处理措施  56
    3.4.4 供体材料  56-57
  3.5 小结  57-59
第四章 扁蓿豆原生质体的培养研究  59-65
  4.1 引言  59
  4.2 材料与方法  59-60
    4.2.1 材料  59
    4.2.2 培养基  59
    4.2.3 主要试剂及仪器  59-60
    4.2.4 试验方法  60
      4.2.4.1 原生质体培养方法  60
      4.2.4.2 培养基激素浓度及种类  60
  4.3 结果与分析  60-63
    4.3.1 原生质体再生细胞的分裂  60-61
    4.3.2 不同培养基对原生质体细胞分裂的影响  61
    4.3.3 激素浓度及配比对原生质体细胞分裂的影响  61-62
    4.3.4 原生质体密度对原生质体细胞分裂的影响  62-63
  4.4 讨论  63-64
    4.4.1 培养方法  63
    4.4.2 激素浓度及配比  63
    4.4.3 原生质体密度  63-64
  4.5 小结  64-65
第五章 讨论与结论  65-69
  5.1 讨论  65-67
    5.1.1 两种豆科牧草愈伤组织系的建立  65
    5.1.2 两种豆科牧草原生质体的分离  65-66
    5.1.3 两种豆科牧草原生质体的培养  66-67
  5.2 结论  67-68
  5.3 研究展望  68-69
附表Ⅰ  69-70
附表Ⅱ  70-71
参考文献  71-77
图版  77-80
致谢  80-81
个人简介  81-82
导师简介  82

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 饲料作物、牧草
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