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4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮代谢及导致DNA损伤的体外实验研究

作　者: 张然
导　师: 赵丽娇
学　校: 北京工业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: NNK 体外代谢 HPB POB-DNA加合物高效液相色谱-质谱联用
分类号: Q523
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

烟草特有亚硝胺是一种存在于烟草烟气及烟草制品中的致癌物，目前已发现8种，其中4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)为明确的强肺癌致癌物。研究表明，NNK发挥致癌作用需要经过代谢，现已知的五种代谢途径中，在细胞色素P450作用下的α-羟基化反应是与致癌作用相关的最重要的途径之一。本论文在分子水平上研究了NNK的体外代谢和代谢导致的DNA加合物，合成了NNK代谢产物4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(HPB)，建立了检测HPB的高效液相色谱-大气压化学电离源质谱联用(HPLC-APCI-MS/MS)检测方法，应用此方法对不同浓度和反应时间下NNK的代谢进行了定量分析。采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用(HPLC-ESI-MS/MS)选择反应扫描(SRM)模式对NNK代谢导致的DNA加合物进行定性检测。主要内容包括以下四个方面：第一，以γ-丁内酯和烟酸乙酯为原料合成了NNK代谢产物HPB，使用硅胶柱层析分离纯化，并用1H NMR、IR、UV和MS对其进行了结构确证。第二，建立了NNK代谢产物HPB的定量分析方法。以HPB及[3,3,4,4-D4]HPB(D4-HPB)为标准样品，通过Agilent Zorbax SB C18反相色谱柱进行分离，采用SRM正离子模式检测m/z166→106和m/z170→106离子通道，绘制了以HPB与D4-HPB浓度比为横坐标、二者SRM峰面积比为纵坐标的标准曲线，标准曲线的相关系数R2=0.9999，表明HPB标准品在0.2~400nmol/L的浓度范围内线性关系良好。测定其日内准确度和相对标准偏差、日间准确度和相对标准偏差及加标回收率，确定此检测方法具有较好的稳定性和重复性。测定了方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，分别为0.025nmol/L和0.05nmol/L。结果表明，该方法满足对HPB的定量分析要求，可以用于NNK代谢生成HPB的检测。第三，使用已建立HPLC-APCI-MS/MS分析方法对不同浓度下NNK体外代谢生成的HPB进行定量检测，探讨了HPB的生成与NNK的浓度、反应时间之间的变化规律。将浓度分别为0.01,0.1,1和10mmol/L的NNK在细胞色素P450酶作用下进行体外代谢反应，去除蛋白后，使用HPLC-APCI-MS/MS对生成的HPB进行定量分析。结果表明，大鼠肝微粒体溶液中富含使NNK代谢的特定亚型酶，此体外代谢体系可成功将NNK代谢，且代谢产物HPB的浓度随NNK浓度和反应时间的增加而增加。第四，采用HPLC-ESI-MS/MS方法SRM模式对NNK代谢导致的DNA加合物进行定性检测。将小牛胸腺DNA与10mmol/L的NNK在细胞色素P450酶作用下反应，去除蛋白后，将DNA酶解为游离的核苷，使用HPLC-ESI-MS/MS的SRM模式检测吡啶羰基丁基DNA加合物(POB-DNA加合物)的生成情况。结果表明，在NNK代谢作用下，反应进行3,6,9和12h后均可明显看到O6-POB-dG这种POB-DNA加合物的生成。本课题通过对NNK体外代谢产物HPB的定量检测和对NNK代谢导致的POB-DNA加合物的定性研究，不仅可以为揭示NNK体外代谢机理和致癌作用提供实验支持，而且可以为设计新型、简便、准确性高的测定烟草特有亚硝胺致癌性生物标记物的方法提供新思路。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
化合物名称及缩写  8-11
第1章绪论  11-21
  1.1 研究背景  11-13
  1.2 NNK 的致癌机制  13-18
    1.2.1 NNK 的代谢  13-17
    1.2.2 NNK 导致 DNA 损伤  17-18
  1.3 NNK 的致癌生性物标记物和检测方法  18-19
  1.4 本课题研究内容  19-21
第2章 HPB 的合成、结构确证及其高效液相色谱-质谱联用定量分析方法的建立  21-37
  2.1 引言  21-22
  2.2 HPB 的合成及结构确认  22-27
    2.2.1 试剂与仪器  22-24
    2.2.2 HPB 的合成  24
    2.2.3 HPB 的结构确证  24-27
    2.2.4 结果与讨论  27
  2.3 定量检测方法的建立  27-35
    2.3.1 试剂与仪器  27-28
    2.3.2 仪器参数  28-29
    2.3.3 标准样品溶液的制备  29-30
    2.3.4 结果与讨论  30-35
  2.4 本章小结  35-37
第3章 NNK 代谢产物 HPB 的HPLC-APCI-MS/MS 定量分析  37-45
  3.1 引言  37
  3.2 试剂与仪器  37-38
    3.2.1 实验试剂  37-38
    3.2.2 实验仪器  38
  3.3 溶液的配置  38-40
    3.3.1 Tris-HCl 溶液(pH 7.4)  38-39
    3.3.2 NNK 溶液  39
    3.3.3 10%大鼠肝微粒体工作液  39-40
  3.4 NNK 的体外代谢  40
  3.5 代谢产物的定量分析  40-41
    3.5.1 分析条件  40
    3.5.2 定量分析  40-41
  3.6 结果与讨论  41-44
    3.6.1 NNK 代谢的条件分析  41-44
    3.6.2 代谢产物 HPB 的生成量分析  44
  3.7 本章小结  44-45
第4章液质联用方法检测 NNK 导致的 DNA 加合物  45-55
  4.1 引言  45
  4.2 试剂与仪器  45-47
    4.2.1 实验试剂  45-46
    4.2.2 实验仪器  46-47
  4.3 溶液的配制  47
    4.3.1 小牛胸腺 DNA 溶液  47
    4.3.2 DNA 抽提液  47
    4.3.3 酶溶液  47
  4.4 NNK 与小牛胸腺 DNA 反应  47-48
  4.5 DNA 的酶解  48
  4.6 DNA 加合物的定性分析  48-52
    4.6.1 分析条件  48-49
    4.6.2 定性分析  49-52
  4.7 结果与讨论  52
  4.8 本章小结  52-55
结论  55-57
参考文献  57-65
攻读硕士学位期间发表学术论文  65-67
致谢  67

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