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酒酒球菌抗酸相关基因序列特征性扩增区域（SCAR）标记

作　者: 李凯
导　师: 刘树文
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 葡萄与葡萄酒学
关键词: 酒酒球菌抗酸相关基因 RAPD标记 SCAR标记
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

苹果酸-乳酸发酵对于优质的红葡萄酒来说是非常重要的一个环节,它不仅可以增加葡萄酒的稳定性,还能进行风味修饰,提高感官特性,从而提升葡萄酒的感官质量。然而对于主导苹果酸-乳酸发酵的乳酸菌来说,酒精发酵之后的葡萄酒是一个非常具有胁迫性的环境,比如高酸度、高SO2浓度、高酒精浓度以及低营养物质含量等,因此使用抗胁迫能力强的乳酸菌对于苹果酸-乳酸发酵的顺利启动和完成具有重要意义。酒酒球菌被认为是苹果酸-乳酸发酵过程中的主导乳酸菌。因此,为了研发发酵性能优良的菌株,对于酒酒球菌的抗胁迫研究是非常必要的。但目前酒酒球菌抗胁迫相关基因的相关研究在国内外鲜有报道。本研究旨在从DNA分子水平上对酒酒球菌的抗酸性进行了解,寻找抗酸菌株与酸敏菌株的基因差异,先筛选与酒酒球菌抗酸性相关的RAPD分子标记,然后转化成更加稳定可靠的SCAR标记,为优良酒酒球菌的筛选以及相关基因功能的研究奠定基础。经研究分析,得出以下结论。1.以葡萄酒学院微生物实验室鉴定保存的30株酒酒球菌为实验材料,进行抗酸和酸敏菌株的筛选,最终得到抗酸菌株7株,酸敏菌株11株。2.将BSA法与RAPD相结合对55条随机引物进行筛选22条引物的多态性良好,其中8条引物反映出了抗酸和酸敏基因池之间的差异,并对这8条引物进行单菌株验证,最终发现引物S200能在抗酸性的菌株中稳定扩增出一条1000bp的条带,命名为S200-1000抗酸性RAPD标记。3.将抗酸性RAPD特异片段回收,与pMD19-T载体连接后测序,获得了该特异片段的序列信息,为酒酒球菌抗酸相关基因的功能研究奠定了基础。4.根据序列信息设计了一对特异性引物,该对引物能在7株抗酸性菌株中稳定扩增出一条1000bp的特异性条带,表明已成功将RAPD标记转化成SCAR标记,命名为SA-1000抗酸性相关标记。RAPD标记和SCAR标记的成功证明抗酸菌株和酸敏菌株的基因组之间确实存在差异性。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-11
第一章文献综述  11-27
  1.1 葡萄酒中的乳酸菌种类  11-13
    1.1.1 乳酸菌的定义及分类  11
    1.1.2 葡萄酒酿造相关的乳酸菌种类  11-13
  1.2 MLF 对于葡萄酒的作用  13-14
    1.2.1 降低葡萄酒的酸度  13
    1.2.2 增强微生物稳定性  13-14
    1.2.3 感官修饰  14
  1.3 影响葡萄酒乳酸菌生长的因素  14-19
    1.3.1 pH  15
    1.3.2 乙醇  15-16
    1.3.3 温度  16
    1.3.4 SO2  16-17
    1.3.5 酵母  17-18
    1.3.6 其他因素  18-19
  1.4 乳酸菌的抗酸机制研究  19-20
  1.5 分子标记的主要方法及在乳酸菌方面的应用  20-24
    1.5.1 rDNA/ rRNA 序列的分子标记  21
      1.5.1.1 16S rDNA/rRNA 序列分析  21
      1.5.1.2 16S～23S rRNA 间隔序列  21
    1.5.2 扩增性 rDNA 限制性酶切片段分析  21-22
    1.5.3 限制性片段长度多态性  22
    1.5.4 片段长度多态性  22-23
    1.5.5 随机扩增多态性 DNA  23-24
    1.5.6 序列特异性扩增区域标记  24
  1.6 本研究的目的和意义  24-25
  1.7 研究内容  25
  1.8 本研究的技术路线  25-27
第二章材料与方法  27-38
  2.1 试验材料  27-31
    2.1.1 试验菌株  27
    2.1.2 主要试剂  27-28
    2.1.3 培养基和试剂的配制  28-30
    2.1.4 主要仪器和设备  30-31
  2.2 试验方法  31-38
    2.2.1 抗酸和酸敏菌株的筛选  31
    2.2.2 酒酒球菌.基因组 DNA 提取  31
    2.2.3 RAPD 标记  31-34
      2.2.3.1 构建抗酸性和酸敏性近等位基因池  31-32
      2.2.3.2 RAPD 反应体系  32-33
      2.2.3.3 凝胶电泳检测  33
      2.2.3.4 引物筛选  33
      2.2.3.5 随机引物在单菌株中验证  33-34
    2.2.4 特异性条带的回收  34
    2.2.5 连接 T 载体  34
    2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  34-35
    2.2.7 转化与筛选  35
    2.2.8 阳性克隆鉴定  35-36
      2.2.8.1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒  35-36
      2.2.8.2 通用引物 M13 对重组质粒进行 PCR 鉴定  36
    2.2.9 测序  36-37
    2.2.10 SCAR 标记  37-38
第三章结果与分析  38-45
  3.1 抗酸和酸敏菌株的筛选  38-39
  3.2 酒酒球菌基因组 DNA 的提取  39
  3.3 RAPD 标记  39-41
    3.3.1 随机引物在近等位基因池中的筛选  39-40
    3.3.2 随机引物在单菌株中的验证  40-41
  3.4 蓝白斑筛选  41
  3.5 特异片断克隆的 PCR 鉴定  41-42
  3.6 特异片段的序列测定结果及同源性分析  42-44
  3.7 SCAR 标记  44-45
第四章讨论  45-47
  4.1 抗酸和酸敏菌株的筛选  45
  4.2 抗酸相关基因的 RAPD 标记  45
  4.3 RAPD 标记向 SCAR 标记的转化  45-46
  4.4 研究展望  46-47
第五章结论  47-48
参考文献  48-54
致谢  54-55
作者简介  55

酒酒球菌抗酸相关基因序列特征性扩增区域（SCAR）标记

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