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银杏雌雄株性别鉴定的分子标记研究

作　者: 朱晓利
导　师: 陈鹏
学　校: 扬州大学
专　业: 植物学
关键词: 银杏雌雄植株性别鉴定 ISSR标记 SRAP标记 scAR标记雄株特异条带
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

银杏,雌雄异株,具重要的经济、生态、社会、舰赏和研究价值。银杏实生植株表现出童期长、性别分化比较迟缓、开花与结实相对较晚等特点。银杏雌株与雄株生长发育的不同表现使其资源的利用途径具有明显差异。银含实生植株的性别在未开花前住往很难通过形态特征加以准确鉴别。鉴于银杏雌雄株资源优化配置对银杏实生植株性别早期鉴定的需要,本研究以扬州大学银杏种质资源圃中的雌雄株为试村,分别运用IssR、sRAP和sCAR标记技术进行性别鉴定,主要结果如下:1、采用改良的cTAB法,成功提取了银含叶片高质量的DNA;提取的银杏DNA经紫外检测A260/A280的值在1.8～2.O之间,经琼脂糖凝胶电泳检测为一条明亮的条带,无拖尾及弥散现象。2、用25条IsSR引物对银杏的雌雄株DNA池分别进行扩增,其中20条引物得到的扩增产物条带多、分离好、背景清晰,每条引物能够稳定扩增得到大约6～12条条带,引物Aw988扩增得到,一条长度约为200bp的银含雄株特异带。3、利用单因素梯度法对影响银含sRAP-PcR的4个因素(Taq酶、Mg2+、dNTP和引物)进行优化,得到了银含最佳sRAP-PCR反应体系为20uL.模板DNA 30-60 ng,Taq酶为o.75 u,dNTP为o.18 mmol.L-1,Mg2+为1.8 mmol·L-1,引物为1.0umol·L-1,其余用ddH20补足。4、以银杏的雌雄株DNA池为模板,用获得的稳定的反应体系对sRAP引物组合进行筛选优化,得到不同引物组合的最适退火温度,退火温度的范围在5l℃-55℃之间。5、66对SRAP引物组合中有46对能对银杏的基因组DNA进行稳定有效的扩增,能够产生4～13条多态性条带,分离完全,大小在100bp～2000bp之间。其中引物组合me5-em2扩增得到一条大小约600bp的雌株特异带,me6-em3引物组合扩增得到一条大小约250bp的雌株特异带。6、对获得的银含雄株IssR特异标记、银含雌株sRAP特异标记成功的进行了克隆、测序,并根据特异条带的测序结果设计scAR特异引物。7、将特异的ISSR标记转化为scAR标记,对已知性别的银杏雌雄株各20株分别进行性别鉴定,鉴别的准确率达到85%。8、将特异的SRAP标记转化为scAR标记的银杏雌雄株性别鉴定,有待于进一步研究。本研究对银杏雌雄株种质资源的早期选择与优化配置及其合理开发利用具有重要的理论意义与应用价值。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
符号与缩写  10-11
1 引言  11-30
  1.1 银杏的生物学特性  11-12
  1.2 银杏的价值  12-14
  1.3 植物性别决定与表达机制  14-17
    1.3.1 性别决定基因决定型  15
    1.3.2 性染色体决定型  15
    1.3.3 X 染色体与常染色体比值决定型  15-16
    1.3.4 植物性别决定的影响因素  16-17
      1.3.4.1 激素对植物性别的影响  16
      1.3.4.2 光照对植物性别的影响  16
      1.3.4.3 养分对植物性别的影响  16-17
      1.3.4.4 温度对植物性别的影响  17
  1.4 植物性别鉴定的研究方法  17-28
    1.4.1 形态学鉴别  17-18
    1.4.2 生理生化鉴别  18
    1.4.3 同工酶鉴别  18-19
    1.4.4 染色体鉴别  19-20
    1.4.5 核酸鉴别  20
    1.4.6 分子标记鉴别  20-21
    1.4.7 常用分子标记的种类及原理  21-28
      1.4.7.1 限制性片段长度多态性(RFLP)  21-22
      1.4.7.2 随机扩增多态性 DNA(RAPD)  22-23
      1.4.7.3 扩增片段长度多态性(AFLP)  23-24
      1.4.7.4 简单重复序列(SSR)  24-25
      1.4.7.5 简单重复序列间扩增(ISSR)  25-26
      1.4.7.6 相关序列扩增多态性(SRAP)  26-27
      1.4.7.7 特征序列扩增区域(SCAR)  27-28
  1.5 银杏性别鉴别的分子标记  28-29
  1.6 本研究拟解决的主要问题  29-30
2 材料与方法  30-38
  2.1 试验材料  30
  2.2 试验主要仪器及设备  30
  2.3 试验主要药品及试剂  30
  2.4 试验技术路线及方法  30-38
    2.4.1 试验技术路线  30-31
    2.4.2 试验方法  31-38
      2.4.2.1 银杏基因组 DNA 的提取  31-32
      2.4.2.2 银杏基因组 DNA 质量的检测  32
      2.4.2.3 银杏雌雄株 DNA 池的构建  32
      2.4.2.4 ISSR-PCR 扩增  32
      2.4.2.5 SRAP-PCR 扩增  32-33
      2.4.2.6 PCR 扩增产物的检测  33
      2.4.2.7 ISSR-PCR 引物的筛选  33-34
      2.4.2.8 SRAP-PCR 引物的筛选  34
      2.4.2.9 银杏特异条带的回收  34-35
      2.4.2.10 银杏特异条带的克隆与测序  35-37
        2.4.2.10.1 连接反应  35
        2.4.2.10.2 连接产物的转化  35-36
        2.4.2.10.3 单克隆的挑选  36
        2.4.2.10.4 质粒 DNA 的提取  36-37
        2.4.2.10.5 质粒 DNA 的检测及测序  37
      2.4.2.11 SCAR 引物的设计  37-38
3 结果与分析  38-49
  3.1 银杏基因组 DNA 质量的检测  38-39
    3.1.1 琼脂糖凝胶电泳检测  38
    3.1.2 紫外光谱检测  38-39
  3.2 ISSR 分子标记鉴别银杏雌雄株性别  39-41
    3.2.1 ISSR 标记引物的筛选  39-40
    3.2.2 银杏 ISSR 标记雄株特异条带的克隆与测序  40-41
  3.3 SRAP 分子标记鉴别银杏雌雄株性别  41-46
    3.3.1 SRAP-PCR 体系优化  41-43
      3.3.1.1 Mg~(2+)梯度的优化  41
      3.3.1.2 引物的梯度优化  41-42
      3.3.1.3 dNTP 的梯度优化  42-43
      3.3.1.4 Taq 酶的梯度优化  43
    3.3.2 SRAP 标记不同引物组合的最适退火温度  43-44
    3.3.3 SRAP-PCR 引物组合的筛选  44-46
    3.3.4 银杏雌株 SRAP 特异标记的克隆及测序  46
  3.4 SCAR 标记鉴定银杏的雌雄株性别  46-49
    3.4.1 SRAP 标记转化 SCAR 标记  46-47
    3.4.2 ISSR 标记转化 SCAR 标记  47-49
4 小结与讨论  49-53
  4.1 小结  49-50
  4.2 讨论  50-53
    4.2.1 ISSR、SRAP 和 SCAR 标记对银杏雌雄株性别鉴别的有效性  50
    4.2.2 银杏雌雄株性别鉴别的 ISSR 标记和 SRAP 标记反应条件的优化  50-51
    4.2.3 ISSR 标记和 SRAP 标记的反应条件对银杏雌雄株性别鉴别结果的影响  51
    4.2.4 ISSR、SRAP 和 SCAR 标记结果在银杏雌雄株早期性别鉴别中的应用  51-53
参考文献  53-65
附录  65-70
致谢  70

银杏雌雄株性别鉴定的分子标记研究

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