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本地天敌对西花蓟马捕食作用的TaqMan荧光定量PCR检测

作　者: 孟祥钦
导　师: 张桂芬
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物安全
关键词: 西花蓟马龟纹瓢虫 S-COI标记 SCAR标记 TaqMan实时荧光定量PCR 环境因素捕食性天敌定量评价
分类号: S476.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

西花蓟马是一种世界性入侵害虫,对我国的农业生产造成了巨大的威胁。目前西花蓟马仅在我国局部地区分布危害,而且由于其抗药性强,利用本土天敌进行生物防治是一项有效的措施。围绕入侵害虫逃离原产地天敌极易爆发成灾,从原产地引进天敌可能会形成新的外来入侵生物的问题,本研究采用COI和SCAR分子标记技术建立了本地天敌对西花蓟马捕食作用的定性检测技术体系。根据GenBank中已知的西花蓟马COI序列设计了1对西花蓟马特异引物F0340(SS-COI引物),其扩增片段大小为340 bp；采用RAPD-SCAR分子标记技术设计了1对西花蓟马种特异引物FOMF/FOMR (SCAR引物),其扩增片段大小为320 bp。检测结果显示,上述2对引物只对西花蓟马以及取食了西花蓟马的龟纹瓢虫、异色瓢虫、大草蛉具有扩增作用,对近缘种属的28种(SS-COI标记技术)或41种(SCAR标记技术)蓟马以及18种同域发生的其他种类的害虫和天敌没有扩增效果。表明,上述两种分子标记技术体系完全可用于西花蓟马入侵地捕食性天敌的筛选研究。此外,SS-COI和SCAR标记技术不仅对不同虫态的西花蓟马具有很好的检测效果,对来自5个不同国家以及我国不同发生地的14个西花蓟马种群亦具有很好的检测效果(SS-COI标记)；同时,还可准确检测出西花蓟马发生地无受害症状的寄主植物组织中是否携带卵(SCAR标记)。表明上述两种分子检测技术体系完全可以用于口岸检疫和国内种苗调运中的检验检疫和监测,对有效阻止西花蓟马的进一步传播扩散具有重要意义。以多拷贝线粒体DNA为基础,根据西花蓟马特有的340 bp片段设计TaqMan实时荧光定量PCR检测引物和探针,FO-77F／R和FO-77 prober.利用质粒DNA标准曲线,测定了不同虫态西花蓟马的DNA拷贝数分别为卵1.32×105、一龄幼虫6.43×105、二龄幼虫3.42×106、预蛹4.24×106、蛹1.02×107、雄性成虫1.96×106、雌性成虫7.95×106。确定了主要环境因素与本地天敌对西花蓟马捕食作用的定量检测结果的关系,其相关关系式分别为消化时间：Y=-0.2169x+6.259(R2=0.851),环境温度：Y=0.0368x+7.2289 (R2=0.9761),捕食数量：Y=0.0705x+6.2467,(R2=0.9674),同域猎物(豆蚜)：Y=-0.2589x+5.479 (R2=0.955),为田间本地天敌对西花蓟马捕食作用的精准评价提供了理论依据。以云南省昆明市呈贡县斗南乡为基地,系统采集辣椒田的捕食性天敌。田间发生的天敌中蜘蛛类显著多于瓢虫类和捕食蝽类,而瓢虫类和捕食蝽类发生数量没有显著差异。TaqMan实时荧光定量PCR检测结果表明,东亚小花蝽对西花蓟马的瞬间捕食能力最强,其次为七星瓢虫、龟纹瓢虫、蟹蛛类、肩毛小花蝽、南方小花蝽、草间小黑蛛、狼蛛,而异色瓢虫对西花蓟马的捕食能力最低,折合成西花蓟马雌成虫的数量分别为：0.0785、0.0412、0.0393、0.0335、0.0321、0.0229、0.0172、0.0151、0.0027头。本研究中本地天敌对西花蓟马捕食作用定性定量评价体系的建立,为有效筛选本地天敌类群,精准评价本地天敌对西花蓟马控制作用的大小,充分保护利用本地自然资源,实现外来物种的可持续管理等提供了理论依据。而西花蓟马SS-COI和SCAR快速检测技术体系的建立对口岸检疫以及蔬菜花卉及其种苗调运中的检疫、检测与监测,以及有效阻截西花蓟马在我国的进一步传播扩散,明确其扩张机制等方面具有重要意义。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-13
第一章绪论  13-27
  1.1 西花蓟马概述  13-15
    1.1.1 西花蓟马起源和分布  13
    1.1.2 西花蓟马的寄主范围及其危害特性  13-14
    1.1.3 西花蓟马的生物防治措施  14-15
  1.2 西花蓟马鉴定检测技术  15-21
    1.2.1 西花蓟马的形态学鉴定  15-16
    1.2.2 西花蓟马形态学鉴定的局限性  16-17
    1.2.3 计算机软件鉴定西花蓟马  17
    1.2.4 西花蓟马的分子检测  17-21
  1.3 捕食者-猎物关系评价  21-25
    1.3.1 捕食者-猎物关系评价方法  21-23
    1.3.2 靶标DNA的选择  23-24
    1.3.3 分子生物学评价技术的误差  24-25
  1.4 研究目的及意义  25
  1.5 研究内容及技术路线  25-27
    1.5.1 研究内容  25-26
    1.5.2 技术路线  26-27
第二章本地天敌对西花蓟马捕食作用定性评价技术体系的建立  27-46
  2.1 材料与方法  27-35
    2.1.1 实验材料  27-30
    2.1.2 实验方法  30-35
  2.2 结果分析  35-44
    2.2.1 线粒体DNA提取质量验证  35-36
    2.2.2 本地天敌对西花蓟马捕食作用SS-COI定性检测体系的建立  36-40
    2.2.3 本地天敌对西花蓟马捕食作用SCAR定性检测体系的建立  40-44
  2.3 小结与讨论  44-46
第三章西花蓟马TAQMAN实时荧光定量PCR技术体系  46-51
  3.1 材料与方法  46-47
    3.1.1 实验材料  46
    3.1.2 实验方法  46-47
  3.2 结果分析  47-50
    3.2.1 西花蓟马TaqMan定量检测体系引物和探针设计  47-48
    3.2.2 标准曲线的建立  48-49
    3.2.3 西花蓟马不同虫态的靶标DNA拷贝数  49-50
  3.3 小结与讨论  50-51
第四章环境因素对天敌捕食西花蓟马定量检测效果的影响  51-57
  4.1 材料与方法  51-53
    4.1.1 实验材料  51-52
    4.1.2 实验方法  52-53
  4.2 结果分析  53-55
    4.2.1 消化时间对定量检测效果的影响  53
    4.2.2 环境温度对定量检测效果的影响  53-54
    4.2.3 同域猎物对定量检测效果的影响  54
    4.2.4 捕食数量对定量检测效果的影响  54-55
  4.3 小结与讨论  55-57
第五章田间捕食性天敌对西花蓟马控制作用的定量评价  57-62
  5.1 材料与方法  57-58
    5.1.1 实验材料  57
    5.1.2 实验方法  57-58
  5.2 结果分析  58-61
    5.2.1 辣椒田内西花蓟马和蚜虫的发生规律  58-59
    5.2.2 西花蓟马发生田内捕食性天敌的发生规律  59-60
    5.2.3 田间天敌对西花蓟马捕食能力的动态趋势  60
    5.2.4 西花蓟马发生高峰期内田间天敌瞬间捕食能力的定量评价  60-61
  5.3 小结与讨论  61-62
第六章全文结论  62-64
  6.1 结论  62-63
  6.2 特色及创新点  63
  6.3 展望  63-64
参考文献  64-74
致谢  74-75
作者简历  75

本地天敌对西花蓟马捕食作用的TaqMan荧光定量PCR检测

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