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间充质干细胞（MSCs）神经向诱导实验条件优化及胞内钙离子浓度动态变化

作　者: 韩朝
导　师: 邹伟
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 骨髓间充质干细胞 脂肪间充质干细胞 成神经诱导 钙离子浓度变化
分类号: R329.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：分离提取骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)及脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells, AMSCs)比较二者生物学特性及体外增殖能力,并探讨三种不同成神经诱导方法对AMSCs向神经样细胞分化过程中的影响,提高AMSCs向神经样细胞分化诱导效率,从而为研究AMSCs向神经样细胞分化机制奠定基础。深入探讨成球诱导方法中细胞内钙离子浓度变化,有助于阐明AMSCs的成神经诱导分化机理,为AMSCs在临床再生医学上的应用提供理论依据。方法：(1)采用密度梯度离心法分离BMSCs及酶消化法体外分离AMSCs。检测MSCs的表面抗原以及将MSCs进行体外成骨诱导,成脂诱导对MSCs的干细胞特性进行鉴定。(2)三种诱导方案诱导AMSCs向神经样细胞分化,包括化学诱导方法、鼠脑条件培养基诱导方法、成神经球分化诱导方法。观察诱导中的形态变化,免疫荧光检测神经细胞特异性标志物β-Ⅲ-Tubulin, NSE和Nissl的表达。确定最高效的诱导方法。(3)采取成神经球诱导方法对AMSCs进行诱导,利用Fluo3/AM对AMSCs及诱导过程中的类神经细胞进行染色,通过流式细胞仪对AMSCs群体细胞的钙离子浓度检测,并通过共聚焦显微镜确定单个细胞中钙离子浓度的变化,研究细胞内游离钙离子浓度在AMSCs向神经样细胞分化过程中的变化。结果：(1)获得的BMSCs及AMSCs可稳定传至20代以上。表型鉴定结果为CD13、 CD90阳性,CD34、CD45阴性,AMSCs的CD106阴性,BMSCs CD106表达弱阳性。成骨细胞分化28d时,Von kossa阳性,向脂肪细胞分化14d时,油红O染色阳性。(2)用化学因子诱导AMSCs向神经样细胞分化,30d时出现成熟神经元标记NSE的表达,阳性值为29.5%,但细胞凋亡明显。鼠脑条件培养基诱导14d时,NSE略有表达,值为12.8%。采用成神经球诱导方法进行7d成神经球诱导,再经过7-9天的分化培养。在7d时有8.9%NSE表达。β-Ⅲ-Tubulin及Nissl在经三种诱导方法诱导成熟后,均为阳性表达。(3)成球法诱导AMSCs向神经样细胞分化过程中,取AMSCs及诱导不同时间点的成神经细胞从细胞整体及个体角度分别证实：在成球诱导法诱导下,通过7天成神经球后,在继续的分化过程1-6天时细胞内钙离子浓度先呈上升趋势,在分化7-9天时达到高峰,随后急剧下落,与细胞培养时细胞发生凋亡的时间一致。结论：AMSCs较BMSCs具有较高的增殖能力,神经球分化方法更能够高效低损伤的诱导AMSCs分化为类神经细胞,细胞内游离钙离子在AMSCs向神经样细胞分化过程中会发生变化,对维持细胞分化,存活均起到了一定的作用。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-9
引言  9-10
1 文献综述脂肪间充质干细胞的神经向分化能力及应用潜能  10-14
2 骨髓及脂肪间充质干细胞的分离培养及鉴定  14-29
  2.1 前言  14
  2.2 材料与方法  14-19
    2.2.1 材料  14
    2.2.2 试剂  14-15
    2.2.3 主要设备  15-16
    2.2.4 基本试剂配制  16-17
    2.2.5 AMSCs的原代培养  17
    2.2.6 MSCs的体外扩增  17-18
    2.2.7 MSCs的形态学观察  18
    2.2.8 流式细胞仪检测MSCs CD分子表面抗原  18
    2.2.9 MSCs向成骨细胞诱导分化  18
    2.2.10 MSCs向成脂细胞诱导分化  18-19
  2.3 结果  19-24
    2.3.1 AMSCs形态学观察  19-20
    2.3.2 BMSCs形态学观察  20-21
    2.3.3 MSCs表面抗原鉴定  21-22
    2.3.4 MSCs成骨细胞诱导分化  22-23
    2.3.5 MSCs成脂细胞诱导分化  23-24
    2.3.6 MSCs增殖能力比较  24
  2.4 讨论  24-28
  2.5 小结  28-29
3 AMSCs神经向诱导实验方法优化  29-48
  3.1 前言  29
  3.2 材料和方法  29-32
    3.2.1 材料  29-30
    3.2.2 试剂  30
    3.2.3 主要设备  30
    3.2.4 基本试剂配制  30-31
    3.2.5 成神经诱导方法  31
    3.2.6 免疫荧光染色  31
    3.2.7 统计学分析  31-32
  3.3 结果  32-42
    3.3.1 AMSCs成神经诱导分化过程形态学观察  32-35
    3.3.2 AMSCs成神经诱导分化过程免疫荧光检测  35-41
    3.3.3 突触形成检测  41
    3.3.4 诱导后类神经元细胞分泌功能检测  41-42
  3.4 讨论  42-47
  3.5 小结  47-48
4 成球诱导法对类神经细胞内钙离子流变化的影响  48-57
  4.1 前言  48-49
  4.2 材料和方法  49-50
    4.2.1 材料  49
    4.2.2 方法  49-50
  4.3 结果  50-54
    4.3.1 成神经分化后细胞内游离Ca~(2+)浓度的变化  50-52
    4.3.2 流式细胞仪检测细胞钙离子流变化  52-54
  4.4 讨论  54-56
  4.5 小结  56-57
结论  57-58
参考文献  58-64
附录A 缩略语表  64-65
附录B T型钙通道与乳腺癌  65-71
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  71
攻读硕士学位期间参加学术会议情况  71-72
致谢  72

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学 > 人体细胞学
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