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鸡朊蛋白参与DF-1细胞增殖粘附的功能研究

作　者: 刁小龙
导　师: 吴润
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸡朊蛋白 DF-1细胞粘附增殖功能研究
分类号: S831
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

【目的】本研究通过克隆禽源U6（cU6）和人源U6（hU6）启动子，构建以绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因的真核表达载体，分别比较二者在Hela细胞和DF-1细胞中的转录活性，进一步分析cU6启动子在禽源细胞体外表达系统中的应用潜力；应用cU6启动子构建真核表达载体，建立鸡朊蛋白（ChPrPC）过表达的DF-1稳定细胞系，为进一步探讨ChPrPC影响禽类细胞分化、增殖及凋亡的分子机制提供稳定的细胞模型；参考PrPC的促细胞增殖及粘附的功能，通过分析ChPrPC过表达对DF-1细胞增殖、粘附和侵袭的影响，为进一步阐明ChPrPC生理功能提供依据。【方法】参考已报道的U6启动子序列设计特异性引物，通过PCR扩增和克隆获得cU6和hU6核心启动子序列，构建以绿色荧光蛋白作为报告基因的禽源和人源U6启动子重组表达载体，分别转染Hela和DF-1细胞系，应用倒置荧光显微镜、荧光定量RT-PCR、Western blot、流式细胞术等方法，分别检测不同的重组载体转染Hela和DF-1细胞12、24和36h后荧光阳性细胞数和EGFP表达水平差异；根据本实验室已克隆的鸡朊蛋白基因全长序列设计引物，通过PCR扩增和克隆获得鸡朊蛋白基因ORF核苷酸序列，结合筛选出的高转录活性cU6启动子，构建ChPrPC重组表达载体，转染DF-1细胞，经G418筛选，建立ChPrPC过表达的DF-1稳定细胞系，应用Western blot和荧光定量RT-PCR方法，检测筛选出的DF-1细胞系鸡朊蛋白基因的表达情况；应用细胞粘附实验、侵袭实验、MTT法和流式细胞术等方法检测ChPrPC对DF-1细胞增殖、粘附和侵袭的影响。【结果】（1）以Hela和DF-1细胞基因组DNA为模板，应用3对特异性引物进行PCR扩增，分别获得hU6，cU6-3和cU6-1启动子区约为420bp，464bp和392bp的预期片段，通过NdeⅠ和NheⅠ双酶切，并与PEGFP-N1载体连接，成功构建重组表达载体：pEGFP-N1-cU6-1，pEGFP-N1-cU6-3和pEGFP-N1-hU6，分别转染Hela和DF-1细胞12、24和36h后，U6启动子转录活性检测结果显示，从转染后12h到36h，3种启动子介导的EGFP蛋白表达水平及荧光阳性细胞数呈逐渐上升趋势，但EGFP mRNA转录水平在逐渐下降。在DF-1细胞中，pEGFP-N1-cU6-1和pEGFP-N1-cU6-3载体的EGFP转录活性显著高于pEGFP-N1-hU6（P<0.01），而在Hela细胞中pEGFP-N1-hU6载体的转录活性最高。而且在两种细胞中，pEGFP-N1-cU6-1载体转录的EGFP mRNA水平和荧光强度均高于pEGFP-N1-cU6-3；（2）成功克隆鸡朊蛋白基因858bp和860bp的核苷酸序列，并与含cU6-1启动子的pCDNA3.0和PEGFP-N1载体连接，构建了重组表达载体：pCDNA-cU6-1-ChPrP和pEGFP-N1-cU6-1-ChPrP。分别转染DF-1细胞，建立了ChPrPC高表达的DF-1细胞系： DF-1-PrP和DF-1-EGFP-PrP，Western blot和荧光定量RT-PCR检测结果显示， DF-1-PrP和DF-1-EGFP-PrP细胞的ChPrPC表达量显著增高，分别是对照组的约60倍和70倍；（3）细胞粘附和侵袭实验结果显示，过表达ChPrPC细胞DF-1-PrP对胞外基质的粘附和侵袭能力显著高于空载体细胞DF-1-cont（P<0.01），而DF-1-cont和正常DF-1细胞粘附及侵袭能力无明显差异；流式细胞术和MTT法检测结果显示，DF-1-PrP，DF-1-cont和DF-1细胞的凋亡率分别是1.7%±0.06%，10.24%±0.11%和11.75%±0.24%，DF-1-PrP细胞凋亡率显著低于其它两组细胞（P<0.01），而且过表达ChPrPC的DF-1-PrP细胞增殖速度明显比DF-1和DF-1-cont细胞快。【结论】（1）成功构建了禽源U6启动子真核表达载体pEGFP-N1-cU6-1，pEGFP-N1-cU6-3和pEGFP-N1-hU6，其中cU6-1启动子转录活性最高，可用于禽类细胞的体外表达载体构建，为今后在禽源细胞中进行外源基因表达提供平台。（2）成功筛选出ChPrPC过表达的DF-1稳定细胞系pEGFP-N1-cU6-1-ChPrP和pCDNA-cU6-1-ChPrP，为我们后续研究ChPrPC影响DF-1细胞粘附、增殖及凋亡的分子机制提供条件。（3）ChPrPC参与DF-1细胞增殖、粘附及侵袭的过程，能够促进DF-1细胞增殖和减缓细胞凋亡，并提高DF-1细胞对细胞外基质的粘附及侵袭的能力，为后续研究ChPrPC促进DF-1细胞增殖、粘附和侵袭的分子机制提供参考，有助于阐明ChPrPC的生理功能。

全文目录

摘要  3-5
Summary  5-10
缩写词英汉对照表  10-12
第一章启动子结构和功能研究进展  12-21
  1 核心启动子结构特征  12-15
    1.1 转录起始位点  13
    1.2 TATA 框  13-14
    1.3 CAAT 框  14
    1.4 BRE 元件  14
    1.5 DPE 元件  14-15
    1.6 MTE 元件  15
  2 基本转录因子  15-17
  3 增强子  17-18
  4 展望  18
  参考文献  18-21
第二章朊蛋白生理功能研究进展  21-40
  1 朊蛋白细胞定位及生理功能  21-33
    1.1 PrPC的结构、细胞定位及转运  21-24
      1.1.1 PrPC的结构特征  21-23
      1.1.2 PrPC的细胞定位及转运  23-24
    1.2 PrPC的生理功能  24-33
      1.2.1 与 PrPC相互作用的蛋白分子  24-25
      1.2.2 PrPC的抗凋亡活性  25-28
      1.2.3 PrPC的抗氧化应激活性  28
      1.2.4 PrPC与铜离子的关系  28-29
      1.2.5 PrPC与跨膜信号转导  29-31
      1.2.6 PrPC在神经元突触中的作用  31
      1.2.7 PrPC与肿瘤的发生  31-32
      1.2.8 PrPC与细胞的增殖粘附  32-33
  2 展望  33
  参考文献  33-40
第三章禽源 U6 启动子的克隆及转录活性分析  40-55
  1 材料与方法  40-45
    1.1 材料  40-41
      1.1.1 细胞与菌株  40
      1.1.2 主要试剂与质粒  40-41
      1.1.3 主要仪器  41
      1.1.4 引物的设计和合成  41
    1.2 方法  41-45
      1.2.1 启动子序列克隆  41-42
      1.2.2 表达载体构建  42-43
      1.2.3 细胞转染  43-44
        1.2.3.1 细胞复苏  43
        1.2.3.2 转染  43-44
      1.2.4 荧光显微镜观察  44
      1.2.5 荧光定量 RT-PCR 检测  44
      1.2.6 Western blot 分析  44-45
      1.2.7 流式细胞术分析  45
      1.2.8 统计学分析  45
  2 结果与分析  45-53
    2.1 cU6 、hU6 启动子序列克隆及分析  45-46
    2.2 绿色荧光蛋白表达载体的构建  46-47
    2.3 不同载体转染后 Hela 和 DF-1 细胞 EGFP 表达水平分析  47-53
  3 讨论  53
  参考文献  53-55
第四章 PrPC过表达的 DF-1 稳定细胞系建立  55-64
  1 材料和方法  55-59
    1.1 材料  55-56
      1.1.1 细胞与菌株  55
      1.1.2 主要试剂与质粒  55-56
      1.1.3 主要仪器  56
      1.1.4 引物的设计和合成  56
    1.2 方法  56-59
      1.2.1 目的片段扩增和检测  56
      1.2.2 表达载体构建  56-57
      1.2.3 细胞培养  57-58
        1.2.3.1 DF-1 细胞复苏  57
        1.2.3.2 DF-1 细胞传代  57-58
        1.2.3.3 DF-1 细胞冻存  58
      1.2.4 细胞转染与稳定转染细胞系筛选  58-59
        1.2.4.1 脂质体介导的 DF-1 细胞转染  58
        1.2.4.2 G418 最佳浓度选择  58
        1.2.4.3 转染 DF-1 稳定细胞系筛选  58-59
      1.2.5 Western blot 鉴定  59
      1.2.6 RT-PCR 分析  59
  2 结果和分析  59-62
    2.1 鸡朊蛋白基因目的 DNA 片段扩增  59-60
    2.2 鸡朊蛋白重组表达载体构建  60
    2.3 过表达鸡朊蛋白的 DF-1 稳定细胞系建立  60-61
    2.4 Western blot 检测  61
    2.5 RT-PCR 分析  61-62
  3 讨论  62-63
  参考文献  63-64
第五章 PrPC过表达对 DF-1 细胞增殖、粘附和侵袭的影响  64-73
  1 材料和方法  64-66
    1.1 材料  64-65
      1.1.1 细胞  64
      1.1.2 主要试剂  64-65
      1.1.3 主要仪器  65
    1.2 方法  65-66
      1.2.1 细胞培养  65
      1.2.2 粘附实验  65
      1.2.3 侵袭实验  65-66
      1.2.4 细胞增殖和凋亡检测  66
        1.2.4.1 MTT 法检测细胞增殖  66
        1.2.4.2 流式细胞仪检测细胞凋亡  66
  2 结果与分析  66-70
    2.1 过表达 ChPrPC促进 DF-1 细胞粘附  66-68
    2.2 过表达 ChPrPC促进 DF-1 细胞侵袭  68-69
    2.3 过表达 ChPrPC促进 DF-1 细胞增殖  69-70
    2.4 过表达 ChPrPC减缓 DF-1 细胞凋亡  70
  3 讨论  70-71
  参考文献  71-73
结论  73-74
致谢  74-75
作者简介  75-77
导师简介  77-78

鸡朊蛋白参与DF-1细胞增殖粘附的功能研究

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