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新型溶瘤腺病毒靶向治疗恶性肿瘤的研究

作　者: 杨耿兵
导　师: 钱程
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 溶瘤腺病毒 RNA干扰 Bmi-1 白血病
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景:溶瘤腺病毒(又称肿瘤特异性增殖病毒或条件复制型腺病毒),利用肿瘤细胞与正常组织细胞间结构及代谢途径的差异,能够靶向肿瘤细胞并在肿瘤细胞内特异性的复制、增殖,最终裂解肿瘤细胞。溶瘤腺病毒既可作为抗癌制剂单独使用,同时又可以作为携带外源基因的载体,使外源基因随病毒复制而长效的表达,因此可发挥病毒和基因的双重疗效,广泛运用于癌症的靶向基因-病毒治疗。腺病毒的组织嗜向性主要由其fiber决定,目前基因治疗常用的载体为人5型腺病毒(Ad5),具有体积小、弥散能力强、致病力低的优点,但也存在感染效率不高的问题。主要原因是Ad5通过fiber与细胞表面柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsakie and adenovirus receptor, CAR)结合进入细胞发挥作用,因此对不表达或低表达CAR的细胞并不表现出明显的黏附作用,限制了其在造血干细胞和一些肿瘤细胞中的应用。人11型腺病毒(Ad11)可感染不依赖CAR受体的细胞,能感染多种干细胞和原代肿瘤细胞,因此构建具有嵌合型的Ad5/F11腺病毒,继承了Ad11的感染特性,能有效转导CAR表达不足的多种重要靶细胞,尤其是对肿瘤细胞及造血干细胞、间充质干细胞等有较高的感染效率。RNAi技术是随着分子生物学的不断发展而产生的新技术,研究表明,小RNA分子可以高效、特异的阻断细胞内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,即称为RNA干扰(RNA interference, RNAi),又称基因转录后沉默,是生物体内抵御外在感染的一种重要保护机制。自从发现以来,广泛运用于生物基因组基因功能的研究、抑制病毒和肿瘤治疗等方面,取得了重要进展,显示出良好的应用前景。Bmi-1基因(B-cell specific moloney murine Leukaemia virus insertion site 1)在1991发现,属于polycomb家族,它不仅是原癌基因,对细胞的生长和增殖有调节作用,而且,它对于成体干细胞和白血病干细胞自我更新是必须的。研究证实人类多种肿瘤,如淋巴瘤、白血病、骨髓增生异常综合征、及大肠癌等肿瘤的恶性程度、侵袭及预后均与Bmi-1基因表达异常有关,因而有望成为一种新的肿瘤分子标志物。目标:为了实现对白血病的治疗,研究Bmi-1基因在白血病发病中的作用,我们利用RNAi技术,构建能携带shRNA的嵌合型溶瘤腺毒载体,并高效长久的表达siRNAs下调Bmi-1基因的表达,同时溶瘤腺病毒可发挥病毒治疗的优点,为治疗白血病的研究提供支持。方法:本课题设计干扰Bmi-1基因表达的shRNA,将该shRNA克隆到穿梭质粒,与pCN103-11fiber同源重组,得到嵌合型溶瘤腺病毒AdCN205-F11-Bmi-1shRNA的完整基因组,进一步在HEK293中包装为病毒。经鉴定正确并扩增纯化后,通过相关实验验证腺病毒和RNAi是否能抑制白血病细胞的增殖和对Bmi-1蛋白的表达。结果:本文通过穿梭质粒与pCN103-11fiber在E.coli BJ5183中同源重组、HEK293细胞中包装生产腺病毒的方法,成功得到能表达shRNA并剪切成为有效siRNAs的嵌合型溶瘤腺病毒。实验结果表明,AdCN205-F11-Bmi-1shRNA可以表达shRNA并产生了siRNAs,Western Blot实验结果显示该病毒可以抑制白血病细胞中目的基因Bmi-1的表达,MTT实验结果显示该病毒有效抑制了白血病细胞的增殖。结论:成功构建了嵌合型溶瘤腺病毒AdCN205-F11-Bmi-1shRNA,该嵌合型溶瘤腺病毒能够抑制Bmi-1基因表达和白血病细胞的增殖,为治疗白血病及相关肿瘤带来新的希望。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
目录  11-14
1 前言  14-28
  1.1 溶瘤腺病毒在肿瘤基因治疗中的研究进展  15-20
    1.1.1 肿瘤基因治疗  15-16
    1.1.2 基因治疗的病毒载体  16-18
    1.1.3 溶瘤腺病毒  18-20
      1.1.3.1 内源性启动子调控腺病毒  19
      1.1.3.2 基因突变调控溶瘤腺病毒  19
      1.1.3.3 对腺病毒外壳蛋白进行修饰  19-20
  1.2 RNA 干扰  20-24
    1.2.1 RNA 干扰现象的发现  20-21
    1.2.2 RNA 干扰的沉默机制  21-22
    1.2.3 RNAi 现象的重要特征  22
    1.2.4 RNAi 在生物医学领域的应用  22-24
      1.2.4.1 RNAi 在研究基因功能的新工具  22-23
      1.2.4.2 RNAi 用于病毒性疾病的治疗  23
      1.2.4.3 RNAi 对肿瘤的治疗  23-24
    1.2.5 shRNA 在 RNAi 的应用  24
  1.3 Bmi-1 基因  24-26
    1.3.1 Bmi-1 基因和蛋白的生物学特征  24-25
    1.3.2 Bmi-1 在干细胞和肿瘤干细胞中的作用  25
    1.3.3 Bmi-1 在恶性肿瘤细胞中的作用  25-26
  1.4 实验方案设计  26-28
    1.4.1 课题来源  26
    1.4.2 实验目的和意义  26
    1.4.3 构建双靶向嵌合型溶瘤腺病毒的实验思路  26-28
    1.4.4 学位论文的创新点、重点、难点及关键问题  28
2 实验材料与方法  28-46
  2.1 实验材料  28-31
    2.1.1 生化试剂  28-29
    2.1.2 培养基及细胞培养液  29
    2.1.4 细胞株系及培养条件  29-30
    2.1.5 主要仪器与设备  30-31
  2.2 实验过程  31-46
    2.2.1 pCN205-11zf-Bmi-1-shRNA 质粒的构建  31-38
      2.2.1.1 Bmi-1-shRNA 片段的制备  31-32
      2.2.1.2 Bmi-1-shRNA 片段与载体 PMD-18T 的连接  32-33
      2.2.1.3 Bmi-1-shRNA 片段克隆到穿梭质粒pCN203  33-34
      2.2.1.4 pCN203203-Bmi-1-shRNA 片段与骨架质粒 pCN3602 的连接  34-35
      2.2.1.5 pCN204-Bmi-1-shRNA 与pCN103-11zf 的同源重组  35-38
    2.2.2 重组质粒pCN205-11zf-Bmi-1-shRNA 的病毒包装  38-39
    2.2.3 腺病毒的小量扩增与鉴定  39-40
    2.2.4 腺病毒大量制备与CsCl 梯度离心纯化病毒  40-41
    2.2.5 腺病毒滴度测定  41
    2.2.6 MTT 法检测细胞存活率  41-42
    2.2.7 目的病毒在白血病细胞复制能力的测定(子代复制能力)  42
    2.2.8 Western blot 检测蛋白的表达水平  42-45
    2.2.9 光学显微镜观察细胞形态变化（Hoechst33342 荧光检测）  45-46
    2.2.10 溶瘤腺病毒Ad205-F11-Bmi-1-shRNA 体内抗白血病的研究  46
3 实验结果与分析  46-56
  3.1 载体构建结果  46-50
    3.1.1 Bmi-1-shRNA 目的基因的鉴定结果  46-47
    3.1.2 PMD-18T-Bmi-1-shRNA 的鉴定结果  47-48
    3.1.3 pCN203-Bmi-1-shRNA 的鉴定结果  48
    3.1.4 pCN04-Bmi-1-shRNA 的鉴定结果  48-49
    3.1.5 pCN205-Bmi-1-shRNA 的鉴定结果  49-50
  3.2 病毒包装鉴定  50-51
  3.3 细胞实验结果  51-54
    3.3.1 病毒制备及滴度测定  51
    3.3.2 目的病毒在体外对不同细胞的活力的影响(MTT 法检测细胞存活率)  51-52
    3.3.3 子代复制能力实验显示 Ad5/F11 在白血病细胞中有较高的复制能力  52-53
    3.3.4 目的病毒对不同细胞中 Bmi-1 蛋白的抑制结果  53-54
    3.3.5 光学显微镜观察形态变化(Hoechst33342 荧光检测)  54
  3.4 目的病毒对白血病移植瘤体内实验的研究治疗  54-56
4 讨论  56-59
5 结论  59-60
6 参考文献  60-64

新型溶瘤腺病毒靶向治疗恶性肿瘤的研究

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