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目的：棉花是新疆最重要的经济作物之一。氮在棉花生长发育过程中具有重要的作用,而大量的施用氮肥和较低的氮肥利用率,在提高棉花产量的同时,也带来了生产成本增加、土壤资源退化及环境污染等一系列农业生产及生态环境问题。因此,筛选氮高效利用的棉花品种(系),分析棉花不同基因型氮素吸收利用的生物学特性及其生理生化机制,充分挖掘氮高效相关基因,培育氮高效利用的棉花品种,对提高棉花氮肥利用效率,节约资源,减少和控制环境污染,最终实现农业的可持续发展具有重要的现实意义。方法：本实验采用苗期水培的方法对新疆33个棉花品种(系)进行氮高效基因型的筛选,在此基础上,以氮高效棉花品种新陆早12号为材料,采用cDNA-AFLP技术结合生物信息学方法克隆棉花氮高效利用相关基因,利用生物信息学方法进行序列比对及功能初步预测,为进一步研究该基因的功能奠定基础。结果：1.采用苗期水培的方法对耐低氮棉花基因型的筛选指标进行分析,并对新疆33个棉花品种(系)进行氮高效基因型的筛选。相对整株干重与相对氮积累量呈极显著正相关(r=0.946**,N=33,P<0.01),与相对氮利用效率呈显著正相关(r=0.432*,N=33,P<0.05),说明相对整株干重可作为棉花苗期氮高效基因型筛选的主要指标,相对氮积累量和相对氮利用效率可作为苗期筛选的辅助指标。根据不同棉花品种的耐低氮能力的不同,可将33个棉花品种(系)划分为三种类型,其中新陆早12号等6个品种(系)的相对整株干重较高,具有在低氮条件下积累干物质能力强,氮利用效率较高等特点,为氮高效棉花品种(系)：炮台一号等6个品种(系)为氮低效棉花品种,其余21个品种(系)属于中间类型。2.利用cDNA-AFLP差异显示技术,分析氮高效棉花品种新陆早12号在低氮胁迫和正常氮营养条件下基因的表达变化,从64对引物组合中共检测到122个差异表达的转录衍生片段(TDFs),对其中51个差异明显的TDFs进行了克隆。获得其中22个克隆并进行了序列分析。通过功能预测,结果表明,与植物光合作用有关差异片段为7个,与信号转导有关差异片段为6个,与细胞膜通透性有关差异片段为4个,与细胞代谢有关差异片段为1个,与离子的转换有关差异片段为4个。它们与毛果杨假性蛋白、光敏素、二硫键异构酶、糖基转移酶同源性很高。3.利用RT-PCR结合生物信息学方法克隆了与氮利用相关的二硫键异构酶(PDI)基因全长cDNA,其序列全长为1484bp,其中5′非编码区为82bp,3′非编码区为322bp,开放阅读框长为1080bp,编码360个氨基酸,将该基因命名为GhPDI,序列登录号为ES802670.1。将该基因在NCBI中进行同源性比对,与蓖麻的PDI基因同源性为88%。对蛋白质结构预测表明,GhPDI基因所编码的蛋白质具有典型的PDI基因家族的蛋白质降解途径(ERAD)、蛋白质转运途径,可初步断定其为PDI基因。结论：本研究采用植物营养学与分子生物学相结合,从改善棉花营养性状出发,通过苗期水培方法对新疆33个棉花品种(系)进行氮高效基因型的筛选,在此基础上,采用cDNA-AFLP差异显示技术结合生物信息学方法从棉花氮高效品种(新陆早12号)中克隆了一个在低氮胁迫下优先表达的二硫键异构酶基因的全长cDNA序列,并利用生物信息学方法进行了序列比对及功能初步预测。1、棉花不同基因型对氮素利用效率存在明显差异,采用苗期水培的方法,对棉花幼苗相对整株干重、相对氮积累量、相对氮利用效率进行分析,可以简单、快速的对大量棉花种质资源的耐低氮特性进行初步筛选。2、低氮胁迫下,棉花多个基因如与光合作用有关基因、与信号传导有关基因的表达均发生变化,利用cDNA-AFLP技术结合生物信息学方法分离低氮胁迫相关基因可为研究棉花适应低氮的分子机理及利用基因工程改良棉花品种奠定基础。
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