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研究背景对于终末期肝脏疾病,肝移植是目前唯一具有明确疗效的治疗手段,移植手术具有高度复杂性,高风险而且费用极其昂贵。另一方面,供体短缺仍然是世界性的难题,供肝来源的难以解决就要求去寻找另一个可替代的治疗方案.肝细胞移植对于肝病患者的治疗提供了新的方向,数年来的实验研究和临床应用证明了该方法的可行性,此方法的简易性,对机体的低创伤性,都使它成为肝脏组织工程领域的一个研究热点。但是,在肝细胞移植的应用中,细胞活性的难以长期维持导致较低的存活率和增殖率,较低的植入效率,以及氧气和营养物质的供给问题都限制了该方法的应用,同时由门静脉循环植入肝细胞有可能导致细胞在受体肺部的栓塞以及门静脉高压等并发症。生物人工肝的研究开展为肝脏功能的暂时性替代提出了新的研究方案,其中一些已经进入了临床试验阶段,生物人工肝主要是通过肝细胞与患者血浆或全血在生物反应器中的相互作用,以此来替代衰竭肝脏的部分功能,它并不是肝脏移植的一个永久性的替代解决方案,实现肝脏功能的部分替代还亟待进-步改进。组织工程领域,通过去细胞化技术制得完整三维支架的方法成为了生物支架制备工艺的一个显著突破。实质器官中完整细胞外基质成分的结构性和功能性分子因其构成的复杂性,在实验中尚不能完全合成,细胞外基质成分如胶原纤维、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等成分可被分离并促进细胞的生长和分化,完整的细胞外基质结构的制备在一系列组织器官的重塑应用中得到了充分的证实。截止目前,细胞外基质成分在促进结构重塑中的分子机制并未完全阐明,但是其表现出明确的生物诱导特性,而细胞外基质所具有的生物相容性、机械力学特性以及降解特性都不足以单独对其作出解释。细胞外基质中的结构性和功能性分子都由组织和器官中的原宿主细胞合成和分泌,因此其在不同的组织器官中的构成和分布都具有特异性,同时决定了细胞外基质作为组织和结构重塑的理想底物支架。实质器官具有复杂的脉管系统以及其构建的毛细血管网有效地保证了所有的细胞分布都能获得足够的氧气和营养物质供应,结构复杂的组织和器官的脱细胞过程相对来说难度是比较大的,这是因为去细胞洗涤剂难以通过传统的去细胞化方法如机械搅拌的作用充分渗透到组织内部,造成洗涤效果的降低。近来Ottet al则突破了传统的机械搅拌和渗透去细胞方法,创新性的采用了通过脉管结构的动态灌注方法获得了完整的小鼠去细胞化心脏支架,不仅保存了心脏的框架结构以及完整的微脉管系统,同时还实现了体外细胞再植。Basak E Uygun通过改进心脏灌洗方法,并将其应用于肝脏生物支架的制备,在保留肝脏特异性细胞外基质成分的同时,完整保留了肝脏的脉管系统,为氧气和营养物质的供应和传递提供了重要结构基础。近来,Thomas Shupe与Pedro M. Baptista等团队采用脉管系统插管,以循环灌注方法获得了完整的肝脏生物支架。目前的肝脏生物支架的制备并没有一个统一的流程,灌注通道不同,灌洗制剂种类不同,浓度不同,也造成了生物支架制备的所需时间不同,不同种类的洗涤剂对细胞外基质微结构的影响也不尽不同。本课题组在既往研究工作中已成功制备去细胞化全肝支架。在此基础上进一步优化去细胞化大鼠肝脏的制作流程。通过离子型洗涤剂梯度浓度递减法的应用在完全洗脱细胞成分的基础上,保留了大鼠肝脏组织的完整三维结构和脉管系统,同时基本完整保留了肝脏组织的细胞外基质成分和生化特性,为进一步研究去细胞化全肝生物支架在体外实验中的应用奠定基础,本课题组自主设计了循环灌注培养装置,通过观察由门静脉和下腔静脉路径植入的人源肝癌细胞系在支架中的粘附、增殖和功能表达情况,对去细胞化肝脏生物支架复合系统的生物功能进行评估,同时对该生物支架在异种生物体内所具有的潜在免疫原性进行了初步研究,为去细胞化技术在大型动物中的应用,构建可用于人体植入的人工肝脏进行初步探索。第一章去细胞化肝脏支架循环灌注培养条件下体外细胞再植目的：利用离子型洗涤剂梯度浓度递减法制备全肝生物支架,并利用改良的循环灌注培养系统实现生物支架的体外细胞再植,观察人源肝癌细胞系在生物支架中的粘附,生长和功能表达状况,为进一步的体外肝脏组织重建奠定实验基础。方法：首先经门静脉灌注含O.02%EDTA的D-Hanks,然后以1%TritonX100灌注,用时约一小时,500ml磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗肝脏,然后1%SDS/0.5%SDS/0.1%SDS各500ml依次灌洗,最后以磷酸盐缓冲液(PBS)充分灌洗肝脏支架,灌注速度均为10ml/min。取另外新鲜肝脏样本,取下腔静脉路径,灌注顺序同上；观察不同灌注路径下的去细胞效果差异。将制备的生物支架浸于PBS溶液中,4℃条件下保存。取约107个HepG2细胞,胰酶消化后配置成4ml的细胞悬液,取全肝生物支架保留中间叶(n=7),结扎其余肝叶,其中2ml细胞悬液由门静脉注入,2ml细胞悬液由肝上下腔静脉注入,每次约5X106数量的细胞共分四次注入,每次操作间隔15分钟,然后将支架置于孵箱环境中静置4小时后开始循环灌注,每日更换培养基,同时取等量细胞平板培养作为对照组,每日更换培养基并留取样本,通过测定循环液中白蛋白以及尿素含量评估细胞功能；通过测定转氨酶指标观察细胞存活状况,绘制曲线观察对比,分析在循环灌注培养过程中,实验组与对照组的白蛋白与尿素产量是否有显著性差异,同时对转氨酶释放量进行统计学分析,所得实验数据用x±s表示,用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,两组之间比较采取析因分析,P<0.05为差异有显著性意义。结果：利用去细胞化肝脏支架构建的体外循环培养系统共进行了7次体外循环培养。其中共有1次培养过程中发生污染,主要原因可能为在构建体外循环装置和培养换液过程中的操作不当导致。在循环灌注培养期间,细胞在支架中粘附、增殖良好,白蛋白和尿素表达量高于平板对照组,而在转氨酶的释放方面,在循环灌注培养的前两天中,实验组转氨酶含量要高于对照组,但是从第三天起,实验组转氨酶的释放量逐步低于平板培养对照组。结论：通过离子型洗涤剂梯度浓度递减法完整制备了全肝生物支架,实现了去细胞化方法的优化。通过自行设计的循环灌注培养装置,实现了人源性肝癌细胞系在异种去细胞化肝脏生物支架中的再植,证明了我们的实验设计的可行性,为下一步通过去细胞化技术构建可用于人体内移植的人工肝脏探索基本的技术路线。第二章去细胞化肝脏支架在异种生物体内免疫原性分析目的：通过离子型洗涤剂梯度浓度递减法制备去细胞化肝脏支架,探索去细胞化肝脏支架在异种生物体内的免疫原性。方法：以SD大鼠作为研究对象,首先以离子型洗涤剂梯度浓度递减法制备全肝生物支架,将红色铸型剂经由脉管系统注入观察脉管系统保存是否完整,在完整支架中随机取材,所取得的组织块大小约1cm×1cm,将组织块置于0.1%过乙酸溶液中,在37℃条件下置于摇床中以300RPM转速持续3个小时。过乙酸溶液浸泡以后,将组织块置于PBS中持续洗涤15分钟,换液后置于PBS溶液中保存。在新西兰大白兔(n=10)背部取约2cm切口,将组织块包埋于背部肌肉中。操作过程中保持无菌原则,并予以术后每日换药,缝合后连续三日给予青霉素输注,早晚各一次,每次八万单位。同时取同批次同体重的新西兰大白兔作为对照组(n=10),单纯取背部切口作为假手术组。每日取血样品送检测量C反应蛋白(CRP)和IgE.并于植入时间达两周及四周时,分批取出植入组织块,进行组织学染色观察。结果组织块植入的前五天中,每日取血样本测定实验组以及假手术组中大白兔的C反应蛋白(CRP)以及IgE的含量,可见：CRP未见明显升高,IgE的含量极低,几乎无法检出,与对照组无明显差异。分别于包埋期达到2周和4周的时间点,手术切开实验组动物背部肌肉组织获取植入组织样本,取出的去细胞化大鼠肝脏组织外观均呈现白色,质地较柔软,被周围肌肉组织包裹,将组织块取出后,以PBS液冲洗组织样本表面残留的血液,组织切片,HE染色结果提示植入组织未见明显细胞浸润；同时对2周以及4周包埋期组织块切片行瑞氏染色,在组织块植入时间达到2周时,植入肝脏组织与背部肌肉组织交界处仍有炎症细胞浸润,而当植入时间达到4周时,实验样本与肌肉组织交界处结合良好,未观察到明显的细胞浸润。同时对植入组织的Masson’s Trichrome染色结果来看,大量胶原纤维的存在表明组织块结构未被明显破坏。结论：离子型洗涤剂梯度浓度递减法可以有效地移除肝脏内的细胞成分而保留低免疫源性的细胞外基质成分,在异种生物体内具有良好的组织相容性,可以作为肝脏组织工程的理想备选支架材料。
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