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防辐胶囊对辐射损伤的防护作用及其机制研究

作　者: 周茜
导　师: 唐瑛
学　校: 湖北中医药大学
专　业: 药理学
关键词: 辐射防辐胶囊造血系统免疫系统 DNA损伤抗氧化
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着科学技术的现代化，核能在生产、科研、医疗、军事等各方面得到了广泛应用，也因为如此，人体受到放射线辐射的机会日益增多。同时由于舰艇的舱室环境存在高温高湿、低剂量辐射等多种不良影响因素，因此低剂量电离辐射已经成为核潜艇长航艇员健康受损的制约战斗力的主要因素。本文通过中医理论，以“扶正祛邪、虚则补之”为治则指导，筛选制定出防辐胶囊，依据现代药理学，研究其在血液系统和免疫系统的防护作用，同时对其抗氧化和DNA损伤防护机制进行分析。为今后中药复方在DNA损伤恢复和免疫等方面的深入研究提供理论基础。【目的】运用均匀设计法对防辐胶囊组成成分进行组方优化，并在组方优化的基础上对其进行药效学及防护机制研究。通过最大耐受量实验对防辐胶囊的安全性进行评估。【方法】一、组方优化采用均匀设计法，将防辐胶囊中的5味中药，按照给药配比分为12组。连续给药14天。于给药第7天，采用60Coγ源照射建立辐射损伤模型。并于照射后第3天、7天，通过血细胞计数仪检测血常规。每天称量体重。通过以上指标筛选出最佳组方。二、药效学⑴将100只昆明种小鼠，雌雄各半，分为5组。连续给药14d，于给药第7天，采用60Coγ源照射建立辐射损伤模型。每天称量体重，并观察受照射小鼠的存活情况，连续30d,记录小鼠的状态和死亡数，计算小鼠30d存活率、提高率和保护系数。⑵将50只雄性昆明种小鼠，按体重随机分为5组。连续给药14d，于给药第7天，采用60Coγ源照射建立辐射损伤模型。每天称量体重，于末次给药后2h，摘眼球取血后脱颈处死，剖取出脾脏、胸腺及右侧股骨。三、作用机制将40只雄性昆明种小鼠，按体重随机分为5组。连续给药14d，于给药第7天，采用60Coγ源照射建立辐射损伤模型。照射后每天称量体重，于末次给药后2h，完成以下指标：骨髓DNA含量测定骨髓细胞微核率外周血彗星实验PCR法对DNA-PKcs修复酶的检测Western blot法对凋亡基因及P53的检测流式细胞仪检测脾脏细胞的凋亡与周期Elisa法对脾脏，胸腺caspase-3,caspase-9进行检测四、最大耐受量实验将40只昆明种小鼠，雌雄各半，按体重随机分为正常组，给药组，每组20只.实验动物禁食禁水12h后，给药组用最高药物浓度和动物的最大胃容量灌胃,即以人口服剂量360倍作一次最大耐受量实验。2次/d给药，正常组灌服同体积双蒸水。给药后实验动物常规饲养，连续观察14d。【结果】一、组方优化1、10种组方对辐射损伤小鼠体重的影响：12个组的小鼠初始体重均无统计学差异。14d后末次体重，12个组的小鼠均有增长，与照射对照组比较，正常组与5号组方增长最为显著，有统计学差异（P<0.01，P<0.05）。说明，5号组方对辐射所致的小鼠体重下降有明显的保护作用。2、10种组方对辐射损伤小鼠血液系统的影响：照射后第3天，7天,与照射对照组比较，照射后第3天时，10个组方组的RBC,WBC均有显著性上升（P<0.01），其中只有5号组方的HGB提高有统计学差异（P<0.01）。照射后第7天时，10个组方组的RBC,WBC,HGB均恢复明显，有显著性差异（P<0.01）。说明，防辐胶囊的组方对辐射损伤具有防护作用，其中5号组方的小鼠血象恢复与正常组差别最小，保护作用最为明显。二、药效学1、防辐胶囊对辐射损伤小鼠30d存活率、提高率和保护系数的影响：与正常组比较，照射对照组和各给药组在照射后存活时间均减少。与照射对照组相比，给药组小鼠的存活时间均增加，其中中剂量组与高剂量组增长具有显著性差异（P<0.01）。各组小鼠30d存活率分别为：正常组为100％，照射对照组为20％，低剂量组为45％，中剂量组为95％，高剂量组为95％。2、防辐胶囊对辐射损伤小鼠血液系统防护作用：与照射对照组比较，3个剂量组的RBC,WBC，PLT,BMNC均有明显上升，有显著性差异（P<0.01）。灌胃中剂量和高剂量防辐胶囊的小鼠脾脏指数有明显提高（P<0.01）。病理学观察显示，正常小鼠脾脏表面光滑无脾结节生成；γ射线照射后，小鼠脾脏萎缩、表面均可见白色的脾结节突起，显微镜下可发现大量核固缩细胞，正常细胞量减少，双核不正常细胞增多。但灌胃防辐胶囊的小鼠在照射后脾结节生成数量明显多于照射对照组，有显著的统计学差异（P<0.01），其中中剂量组脾结节生成数量最多，病理切片与正常组区别最小。3、防辐胶囊对辐射损伤小鼠免疫系统防护作用：与正常组比较，照射后脾脏T、B淋巴细胞增殖反应能力和CD4~+、CD8~+活性均明显下降，与照射对照组比较，灌胃不同浓度防辐胶囊小鼠的T、B淋巴细胞增殖能力均恢复，CD4~+、CD8~+活性上升，其中中剂量组和高剂量组的恢复明显，有统计学差异（P<0.01，P<0.05）。给药后的小鼠血清中的TGF-β1,IL-2，IL-10均有差异，其中中剂量和高剂量组有明显统计学差异（P<0.01，P<0.05）。三、作用机制1、防辐胶囊对电离辐射造成的小鼠DNA损伤的防护作用：彗星实验及骨髓DNA含量实验均显示，电离辐射对DNA损伤十分明显，与正常组比较照射对照组有显著性差异（P<0.01）。由流式细胞仪检测得出：照射后的小鼠的脾脏细胞的凋亡明显增加且细胞周期明显被阻滞在G0/G1期，与照射对照组比较，给药组的小鼠有明显恢复，其中中剂量组有统计学差异（P<0.01，P<0.05）。由PCR检测发现，正常组和中剂量组，DNA-PKcs的表达水平显著高于照射对照组(P＜0.05)。Western blot结果显示：与照射对照组对比，给药组P53和Bax蛋白的表达下降，Bcl-2的表达升高，且与给药剂量成线性关系。2、防辐胶囊对电离辐射造成的小鼠氧化损伤的防护作用：与正常组比较，照射后的小鼠外周血血清中的SOD及GSH-PX活性明显降低，MDA含量明显上升。与照射对照组比较，灌胃防辐胶囊的小鼠外周血血清中的SOD活性，MDA含量及GSH-PX活性均有显著性差异（P<0.01）。四、最大耐受量实验结果未见动物发生死亡，灌药后动物活动略有减少，无其他异常生物学特征，一般1h内恢复正常。在2-14d内行为精神状态正常，毛色光亮，摄食、饮水情况良好，未出现不良反应。14d后处死全部小鼠，经解剖尸检后未发现内脏器官异常。2组小鼠体质量变化比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

全文目录

摘要  6-11
Abstract  11-17
缩略词表  17-18
前言  18-22
技术路线图  22-23
第一部分防辐胶囊的组方优化  23-29
  1、材料与方法  23-25
    1.1 实验动物与试剂  23-24
    1.2 实验方法  24-25
  2、统计学方法  25
  3、结果  25-27
    3.1 体重变化  25-26
    3.2 外周血象变化  26-27
  4、讨论  27-29
第二部分药效学  29-53
  防辐胶囊对辐射损伤小鼠血液系统的防护作用  29-43
    1、材料与方法  29-33
      1.1 实验动物与试剂  29
      1.2 实验方法  29-33
    2、统计学方法  33
    3、结果  33-40
      3.1 防辐胶囊对受照射小鼠体重的影响  33-34
      3.2 防辐胶囊对 30 天存活率的影响  34-35
      3.3 防辐胶囊对受照射小鼠血常规及骨髓细胞计数的影响  35-38
      3.4 防辐胶囊对受照射小鼠脾脏指数及脾结节计数的影响  38-39
      3.5 病理  39-40
    4、讨论  40-43
  防辐胶囊对辐射损伤小鼠免疫系统的防护作用  43-53
    1、材料与方法  43-46
      1.1 实验动物与试剂  43
      1.2 实验方法  43-46
    2、统计学方法  46
    3、结果  46-49
      3.1 防辐胶囊对受照射小鼠 ConA/LPS 诱导脾脏 T、B 淋巴细胞增殖能力的影响  46-47
      3.2 防辐胶囊对胸腺及脾脏 T 淋巴细胞亚群的影响  47-48
      3.3 防辐胶囊对外周血清中细胞因子的影响  48-49
    4、讨论  49-53
第三部分防辐胶囊作用机制研究  53-81
  1、材料与方法  53-67
    1.1 实验动物与试剂  53
    1.2 实验方法  53-67
  2、统计学方法  67
  3、实验结果  67-76
    3.1 防辐胶囊对辐射损伤小鼠骨髓 DNA 损伤的防护作用  67-68
    3.2 防辐胶囊对辐射损伤小鼠外周血 DNA 损伤的防护作用  68-69
    3.3 防辐胶囊对脾脏 DNA-PKcs 表达的影响  69-70
    3.4 防辐胶囊对 P53 表达的影响  70-71
    3.5 流式细胞术检测防辐胶囊对脾脏细胞凋亡的影响  71-72
    3.6 流式细胞术检测防辐胶囊对脾脏细胞周期的影响  72-74
    3.7 防辐胶囊对脾脏细胞 Caspase-3，Caspase-9 活性及细胞色素 C 的影响  74
    3.8 防辐胶囊对外周血血清中 SOD 活性，MDA 含量及GSH-PX 活性的影响  74-76
  4、讨论  76-81
第四部分防辐胶囊最大耐受量实验  81-85
  1、实验目的  81
  2、材料与方法  81-82
    2.1 实验动物与试剂  81
    2.2 实验方法  81-82
  3、统计学方法  82
  4、结果  82-83
    4.1 灌胃前后体重变化  82-83
    4.2 灌胃前后状态分析  83
  5、讨论  83-85
参考文献  85-90
发表文章和科研工作  90-91
致谢  91

防辐胶囊对辐射损伤的防护作用及其机制研究

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