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兔异体脂肪干细胞增强脂肪移植效果的实验研究

作　者: 杨涛
导　师: 刘斌; 刘彦普
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 脂肪移植异体移植脂肪干细胞免疫原性
分类号: R782.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

【背景】由于肿瘤术后、外伤、颌面部烧伤等各种原因造成的颌面部软组织缺损，直接影响患者发音、咀嚼、吞咽、呼吸及美观等多项生理功能，是口腔颌面外科医师面临的主要问题之一，如何改善此类生理功能，提高患者术后的生存质量，是每一位口腔颌面外科医生应该掌握的基本技能之一。目前临床上主要的修复方法有自体组织瓣、人工合成材料、颗粒脂肪移植、可注射自体脂肪干细胞移植等方法，其中自体脂肪干细胞复合颗粒脂肪能提高脂肪移植效果，但是，自体脂肪干细胞应用存在一定的局限性，如体外培养自体干细胞周期长、部分患者自身干细胞来源有限或不愿接受脂肪抽吸术等。文献报道，异体干细胞具有免疫原性低的特点，并且已用于部分临床病例。【目的】探讨异体脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)复合脂肪颗（adiposegranule，AG）、富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin, PRF）降低移植脂肪吸收率，改善脂肪移植效果以及监测移植后免疫学指标，为临床上实施异体脂肪干细胞移植提供实验基础及理论基础。【方法】1、建立兔耳动物模型：以兔耳中动脉末端动静脉分叉处与耳中动脉与内侧耳缘静脉交界的中点为圆心,画一个半径15cm的圆。用骨膜剥离器将皮肤与骨膜分开，按照实验分组要求，用18#注射器将2ml复合物移植到此部位。2、家兔脂肪干细胞的分离、培养及鉴定：无菌条件下，从家兔背部取出约8ml的脂肪，利用消化离心法培养脂肪干细胞。将兔脂肪干细胞置于37℃、5%CO2的培养箱培养。通过HE染色、流式检测鉴定移植前的细胞是否为脂肪干细胞。3、PRF的制备:无菌条件下，取家兔血液20ml置于玻璃离心管内，迅速离心，3000r/min，10min，取离心管内中间层部分，置于4℃冰箱内备用。4、实验分组：取30只健康新西兰兔，随机分成5组，每组6只：A组，AG；B组：AG+PRF；C组:AG+ADSC（sadipose-derived stem cells，脂肪干细胞）；D组：AG+PRF+自体ADSCs；E组：AG+PRF+异体ADSCs。5、可注射脂肪颗粒复合物的体内移植：将AG、自体、异体ADSCs、PRF按照实验分组移植到兔耳的相应部位。6、复合物移植后，对其形态学及其免疫学观测：通过大体外观、HE染色、兔耳透光实验、卡尺、B超测量各组存活率来观测形态学的改变。通过组织切片HE染色观察、外周血淋巴细胞亚群CD4/CD8测定、血浆IL-2和IL-4测定进行免疫学评价。7、统计学分析方法。利用SPSS18.0对数据进行分析，实验各组之间进行比较。【结果】1、从家兔背部分离并培养的第三代脂肪干细胞，镜下观察细胞呈短梭形铺满瓶底，HE染色细胞呈长梭形或多边形，流式细胞仪检测培养细胞CD29为阳性（87.39±2.85）%，CD31呈阴性，（1.37±0.61）%，通过成骨、成脂诱导发现其具有成骨、成脂分化的潜能。2、复合物移植到家兔体内后，在形态学以及免疫学方面的比较在形态学方面，5个分组移植后，在大体外观方面，均无液化、坏死、感染，移植后家兔全身情况无明显异常；通过卡尺、B超测量并计算出各组的存活率，移植后3月A至E五组脂肪存活率分别为：54.39±7.72，63.72±3.93，65.39±2.48，72.62±4.72，72.56±4.26，移植后6月A至E五组脂肪存活率分别为38.73±9.81，61.29±1.61，62.34±1.65，73.94±2.73，69.83±5.12，经统计学分析，D、E两组无显著性差异（P>0.05），但与其他各组存在显著性差异(P <0．05)；切片HE染色，各组脂肪组织结构清晰完整，未见明显的液化、坏死及感染等，而在组织学方面，D、E两组未见明显差异，但与其他各组有明显差异。在免疫学方面，通过切片HE染色，各组均未见明显的液化、坏死等，而且无明显的免疫排斥反应；外周血淋巴亚群CD4/CD8比值，移植后3月，D、E两组分别为：1.38±0.059，1.31±0.063，移植后6月，D、E两组分别为1.31±0.05，1.21±0.05，统计学分析，D组、E组两组间无显著性差异（P>0.05),无明显的免疫排斥反应；血浆IL-2的水平，移植后3个月后，D、E两组分别为：161.5±12.41，166.1±12.43，移植后6月，血浆IL-2的水平，D、E两组分别为150.8±12.51，152.5±12.49，血浆IL-4的水平，移植后3个月，D、E两组分别为：64.92±8.61，63.18±8.57，移植后6月血浆IL-4的水平，D、E两组分别为61.58±8.64，62.58±8.85，统计学分析发现D组、E组两组间无显著性差异（P>0.05)，无明显的免疫排斥反应。【结论】1、从家兔体内经过消化离心法得到的细胞，具有较强的增殖、分化能力，符合脂肪干细胞的特征。2、ADSCs复合PRF能显著提高移植颗粒脂肪的存活率，促进脂肪再生。异体ADSCs与自体ADSCs具有类似促进脂肪再生作用。3、异体ADSCs移植后，未见明显的免疫排斥反应，可以为异体脂肪干细胞移植在临床上的应用提供重要的实验依据。

兔异体脂肪干细胞增强脂肪移植效果的实验研究

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