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VN对高糖培养下HUVEC作用的初步探讨

作　者: 王玉风
导　师: 董晓光
学　校: 青岛大学
专　业: 眼科学
关键词: 玻连蛋白高糖细胞骨架迁移成管
分类号: R774
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的1.观察高糖培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)中玻连蛋白(vitronectin, VN)表达水平的改变,细胞微丝骨架结构的变化,以及细胞迁移能力、成管能力的变化；2.检测VN表达水平改变对高糖培养下HUVEC中骨架结构、细胞迁移、细胞成管能力的影响。方法第一部分：建立高糖培养的HUVEC体外模型,并常规培养HUVEC作为正常对照,实验分为组1(正常组：用含葡萄糖浓度为25mmol/L的DMEM培养液培养HUVEC)和组2(高糖组：用含葡萄糖浓度为50mmol/L的DMEM培养液培养HUVEC))。分别使用Western Blot检测两组中VN的蛋白表达情况,利用免疫荧光细胞化学染色结合荧光显微镜观察两组中细胞微丝骨架的变化,用划痕法检测细胞迁移能力的改变,Matrigel方法观察细胞成管情况。利用独立样本t检验对组1和组2的数据进行分析。第二部分：高糖培养HUVEC,利用干扰RNA技术干扰VN的表达,实验分为组2(高糖组：用含葡萄糖浓度为50mmol/L的DMEM培养液培养HUVEC))、组3(阴性干扰组：用control SiRNA预干扰HUVEC,再用含葡萄糖浓度为50mmol/L的DMEM培养液培养)和组4(阳性干扰组：用VN SiRNA预干扰HUVEC,再用含葡萄糖浓度为50mmol/L的DMEM培养液培养)。重复Western Blot实验、免疫荧光实验、划痕实验、Matrigel实验。利用单因素方差分析中的LSD检验对组2、组3、组4的数据进行分析。结果第一部分：1. Western Blot结果显示,在分组培养的Oh时,组1和组2中的VN蛋白表达量分别是(1.098±0.085)、(1.091±0.068),两组之间的差异无统计学意义(t1，2=0.111,P，2，>0.05)；在分组培养的24h时,组1和组2中VN的蛋白表达量分别为(0.893±0.119)(1.295±0.080)，两组之间的差异有统计学意义(t1，2=-4.857,P1，2<0.05)；48h时组1和组2中VN的蛋白表达量分别为(0.874±0.115)(1.724±0.098),两组之间的差异也有统计学意义(t，1，2=-9.710,P1，2<0.05)。2.免疫荧光结果显示,在24h和48h时,组2中都伴有更加明显的细胞微丝骨架结构的改变。3.划痕法表明,24h时组1和组2中迁移入划痕的细胞数分别为(198.000±15.880)(242.000±11.130)个,两组之间的差异有统计学意义(t1，2=-5.495,P1，2<0.05)；48h时组1和组2中迁移入划痕的细胞数分别为(293.000±8.681)(334.000±10.863)个,两组之间的差异也有统计学意义(t1，2=-7.193,P1，2<0.05)。4. Matrigel法证实,6h时组2中形成的闭合管腔数目(120.000±9.813)多于组1(91.000±9.867),两组之间的差异有统计学意义(t1，2=-5.163,P1，2<0.05)；12h时组2中形成的闭合管腔数目(19.000±3.209)也多于组1(8.000±3.011),两组之间的差异也有统计学意义(t1，2=-5.659,P1，2<0.05)。第二部分：1. Western Blot结果显示,高糖培养Oh时组2、组3、组4中的VN蛋白表达量分别为(1.091±0.068)(1.002±0.029)(1.104±0.144),三组之间的差异无统计学意义(F=1.064,P>0.05)；高糖培养24h时组2、组3、组4中的VN蛋白表达量分别为(1.295±0.080)(1.078±0.090)(0.859±0.1150),三组之间的差异均有统计学意义(LSD2,3=0.217,P2，3<0.05；LSD2,4=0.435,P2，4<0.05；LSD3,4=0.219,P3，4<0.05)；48h时组2、组3、组4中的VN蛋白表达量也依次降低(1.724±0.098)(1.148±0.163)(0.693±0.167),三组之间的差异亦有统计学意义(LSD2,3=0.576,P2，3<0.05；LSD2,4=1.031,P2,4<0.05；LSD3,4=0.455,P3，4<0.05)。2.免疫荧光结果显示,24h时组2中的细胞微丝骨架结构最为明显,组3次之,组4最不显著；48h时细胞微丝骨架分布亦然。3.划痕实验表明,高糖培养24h时组2、组3、组4中迁移入划痕的细胞数量依次减少(242.000±11.130)(199.000±7.055)(170.000±9.070),三组之间的差异均有统计学意义(LSD2,3=42.833,P2，3<0.05；LSD2,4=71.333,P2，4<0.05；LSD3，4=28.500,P3，4<0.05)；48h时组2、组3、组4中迁移入划痕的细胞数量分别为(334.000±10.863)(265.000±22.554)(227.000±12.613),三组之间的差异也均有统计学意义(LSD2,3=68.667,P2,3<0.05；LSD2,4==107.500,P2，4<0.05；LSD3，4=38.833,P3，4<0.05)。4. Matrigel法检测,高糖培养6h时组2、组3、组4中细胞形成的血管腔数目依次为(120.000±9.813)(88.000±6.976)(55.000±8.886),三组之间的差异有统计学意义(LSD2,3=3.283,P2，3<0.05；LSD2,4=6.567,P2,4<0.05；LSD3,4=3.283,P3.4<0.05)；12h时组2、组3、组4中细胞形成的血管腔数目也依次减少(19.000±3.209)(14.000±1.789)(8.000±3.578),三组之间的差异有统计学意义(LSD2,3=4.500,P2,3<0.05；LSD2，4=1.050,P2，4<0.05；LSD3，4=6.000,P3，4<0.05)。结论1.高糖可诱导HUVEC中VN表达增高,并伴有细胞骨架重塑、细胞迁移能力增加、细胞成管能力增强。2.抑制VN的表达可导致高糖环境中HUVEC细胞骨架结构改变、细胞迁移能力降低、细胞成管能力下降。3.VN可能是糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)新生血管形成的一个重要影响因素。

全文目录

摘要  2-5
Abstract  5-10
引言  10-11
第1章材料和方法  11-20
  1.1 材料  11-13
    1.1.1 细胞株及试验试剂  11-12
    1.1.2 试剂配制  12
    1.1.3 实验耗材  12-13
    1.1.4 实验仪器  13
  1.2 方法  13-20
    1.2.1 第一部分  13-17
      1.2.1.1 HUVEC的分组培养  13-14
      1.2.1.2 Western Blot方法检测各组中VN的蛋白表达情况  14-17
      1.2.1.3 免疫荧光观察各组中HUVEC的微丝骨架结构  17
      1.2.1.4 划痕法检测各组中HUVEC的细胞迁移情况  17
      1.2.1.5 Marigel法检测各组中HUVEC的成管情况  17
    1.2.2 第二部分  17-19
      1.2.2.1 HUVEC的分组培养  18
      1.2.2.2 Western Blot方法检测各组中VN的蛋白表达情况  18
      1.2.2.3 免疫荧光观察各组中HUVEC的微丝骨架结构  18-19
      1.2.2.4 划痕法检测各组中HUVEC的细胞迁移情况  19
      1.2.2.5 Matrigel法检测各组中HUVEC的成管情况  19
    1.2.3 统计学分析  19-20
第2章结果  20-23
  2.1 第一部分  20-21
    2.1.1 Western Blot检测  20
    2.1.2 免疫荧光细胞化学法检测  20
    2.1.3 划痕法检测  20
    2.1.4 Matrigel法检测  20-21
  2.2 第二部分  21-23
    2.2.1 Western Blot检测  21
    2.2.2 免疫荧光细胞化学法检测  21
    2.2.3 划痕法检测  21
    2.2.4 Matrigel法检测  21-23
第3章讨论  23-26
结论  26-27
参考文献  27-29
综述  29-38
  参考文献  33-38
攻读学位期间研究成果  38-39
附录  39-47
致谢  47-48

VN对高糖培养下HUVEC作用的初步探讨

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