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ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗SKH-1小鼠皮肤鳞状细胞癌的疗效及免疫学机制研究

作　者: 涂庆峰
导　师: 王秀丽
学　校: 安徽医科大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 皮肤鳞癌 光动力治疗 5-氨基酮戊酸 纳米粒 聚乳酸羟基乙酸
分类号: R739.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


背景皮肤鳞状细胞癌（SCC）是皮肤恶性肿瘤之一，临床发生率较高，传统治疗方法多为手术切除，但对于部位特殊，皮损面积较大的患者，往往手术切除受限。5-氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）是以5-氨基酮戊酸（ALA）为光敏剂的光动力治疗，通过光动力反应，选择性破坏肿瘤组织或增生活跃的细胞的全新治疗技术，具有疗效好、无明显痛苦、无疤痕形成，不受皮损数目和部位的限制、可重复治疗等优势。但是ALA-PDT的缺点是治疗深度有限，在治疗深在性的皮肤SCC时疗效还不甚理想，这主要与给药后ALA在SCC组织中的浓度低、分布不均，光动力反应的效率有限有关。为了进一步提高ALA-PDT治疗皮肤SCC的疗效，我们设想通过纳米技术和微针给药来增强光动力疗效。因此，本研究应用前期我们课题组制备出的5-氨基酮戊酸聚乳酸羟基乙酸纳米粒（ALA PLGA NPs），联合微针给药，对小鼠皮肤鳞状细胞癌进行光动力治疗，通过纳米粒封包ALA，增强光敏剂ALA的稳定性、通过纳米粒的EPR效应（enhanced permeability and retention effect，EPR effect），提高ALA对皮肤SCC组织的靶向选择性，通过微针给药提高ALA PLGANPs的渗透性，从而提高ALA的光动力学效应，并对免疫学机制进行探索性研究。目的探索新型ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗SKH-1小鼠皮肤鳞状细胞癌疗效和对小鼠的免疫学效应的研究。包括（1）ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗SKH-1成模小鼠的药代动力学研究；（2）ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗SKH-1小鼠皮肤鳞状细胞癌疗效研究；（3）ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗SKH-1小鼠皮肤鳞状细胞癌免疫学效应研究。方法（1）ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗SKH-1成模小鼠的药代动力学研究：建立SKH-1小鼠多发性皮肤鳞状细胞癌模型，瘤体直径长至1~5mm后，选取24只瘤体直径约1~5mm，病理活检证实为SCC的荷瘤小鼠，随机分为A、B、C、D4组，A组（6只）ALA PLGA NPs联合微针给药组、B组（6只）单纯外敷ALA PLGA NPs组、C组（6只）单纯外敷ALA组、D组（6只）ALA联合微针给药组，进行SKH-1成模小鼠ALA PLGA NPs微针给药研究。每组随机选取3只荷瘤小鼠，进行ALA/PpⅨ药代动力学研究，4组小鼠给予不同处理，A组微针处理皮损后外敷ALA PLGA NPs霜剂（含量等同于0.8%ALA）、B组单纯外敷ALA PLGA NPs的霜剂（含量等同于0.8%ALA）、C组单纯外敷8%ALA霜剂、D组微针处理皮损后外敷8%ALA霜剂。curalux光谱分析仪检测上述各组成模小鼠肿瘤部位及周边荧光强度随时间的变化，并绘制荧光变化曲线，即ALA/PpⅨ药代动力学研究；每组随机选取3只荷瘤小鼠，相机拍摄小鼠荧光图片，并通过荧光显微镜观察肿瘤组织内PpⅨ荧光分布情况；采用透射电镜观察治疗组ALA PLGA NPs PDT联合微针给药后ALA PLGA NPs在肿瘤组织内的分布。（2）ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗SKH-1小鼠皮肤鳞状细胞癌疗效研究：选取50只瘤体直径约1~5mm，病理活检证实为SCC的荷瘤小鼠，随机分为A、B、C、D、E5组，A组（10只）采用ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗，B组（10只）采用ALA PLGA NPs PDT治疗，C组（10只）采用ALA-PDT治疗，D组（10只）采用ALA-PDT联合微针给药治疗， E组（10只）为空白对照组，不予任何治疗。A、B、C、D各组每周治疗一次，连续4次治疗结束后观察疗效。（3）ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗SKH-1小鼠皮肤鳞状细胞癌对小鼠的免疫学效应研究：选取35只瘤体直径约1~5mm，病理活检证实为SCC的荷瘤小鼠，随机分为A、B、C、D、E5组，A组（7只）采用ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗，B组（7只）采用ALA PLGA NPs PDT治疗，C组（7只）采用单纯红光照射治疗，D组（7只）采用ALA-PDT治疗，E组（7只）为空白对照组，不予任何治疗。治疗前及治疗后1d、3d、7d取材，采用免疫组化方法对肿瘤组织或外观正常组织局部CD4~+T，CD8~+T分布进行研究；流式细胞术检测小鼠的CD4~+T细胞(CD3~+CD4~+)，CD8~+T细胞(CD3~+CD8~+)；流式细胞术检测小鼠的外周血细胞因子TNF-α，IL-6，IL-10的表达量。结果（1）ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗SKH-1成模小鼠的药代动力学研究结果：curalux光谱分析仪检测ALA PLGA NPs PDT联合微针给药组SCC细胞内产生的PpⅨ荧光强度在敷药后6小时达到高峰，之后缓慢降低。并检测SCC周边0.5cm、1cm处荧光显示ALA PLGA NPs联合微针给药后，荧光局限在肿瘤部位，肿瘤周边荧光强度低。单纯外敷ALA PLGA NPs组PpⅨ荧光强度也在6小时达高峰，之后缓慢降低，但荧光强度低于ALA PLGA NPs联合微针给药组，荧光也局限在肿瘤部位，肿瘤周边荧光强度低。ALA PLGA NPs联合微针给药组和单纯外敷ALA PLGANPs组荧光强度均低于单纯外敷ALA组和ALA联合微针给药组（p＜0.05）。单纯外敷ALA组SCC细胞内产生的PpⅨ荧光强度在敷药后5小时达到高峰，之后缓慢降低。并检测SCC周边0.5cm、1cm处荧光显示荧光在肿瘤部位及肿瘤周边荧光强度均很强。ALA联合微针给药组PpⅨ荧光强度也在5小时达高峰，之后缓慢降低，但荧光强度低于低于ALA组（p＜0.05）。并检测SCC周边0.5cm、1cm处荧光显示荧光在肿瘤部位及肿瘤周边荧光强度低于ALA组（p＜0.05）。小鼠荧光图片显示微针处理后外敷ALA与单纯外敷ALA处理比较，ALA被系统吸收并扩散至小鼠全身，以至小鼠周身遍布荧光。微针处理后外敷ALA PLGA NPs与单纯外敷ALA PLGA NPs组比较，荧光图片显示较强荧光，但均显示了很好的靶向性，与单纯外敷ALA组和ALA联合微针处理组比较，荧光局限在肿瘤部位，肿瘤周边荧光强度小，未扩散全身，可见ALA PLGA NPs的靶向作用更好。荧光显微镜显示微针处理后外敷ALA与单纯外敷ALA比较加微针后，荧光显微镜显示荧光强度均很强，微针处理后外敷ALA PLGA NPs与单纯外敷ALA PLGA NPs组比较加微针后，有利于增加ALA PLGANPs的通透性，荧光显微镜显示荧光强度较强。对治疗组微针处理皮损，外敷ALAPLGA NPs霜剂3h后电镜观察结果显示细胞质内可见大量呈球形的ALA PLGA NPs，大部分的ALA PLGA NPs形态依然保持完整。（2）临床疗效研究结果：ALA PLGA NPsPDT联合微针给药组完全缓解率84.06%，直径1~4mm、厚度＜2.5mm肿瘤治疗效果好，可完全消退；直径＞4mm、厚度＞2.5mm治疗结束后对肿瘤抑制作用差。末次治疗结束2周后完全缓解瘤体组织病理学示皮损消失，结构恢复正常。ALA PLGA NPsPDT组完全缓解率62.75%，治疗效果低于ALA PLGA NPs PDT联合微针给药组，可能与敷药后ALA PLGA NPs进入鳞癌组织的量小、释放的ALA少有关，光动力效果差。ALA-PDT组完全缓解率88.89%、ALA-PDT联合微针给药组完全缓解率90.38%，直径1~4mm、厚度＜2.5mm肿瘤治疗效果好，可完全消退；直径＞4mm、厚度＞2.5mm治疗结束后可部分消退。末次治疗结束2周后完全缓解瘤体组织病理学示皮损消失，结构恢复正常。肿瘤空白对照组每只小鼠瘤体瘤体数目由最初的数枚增至十余枚，部分小鼠背部瘤体密集呈片状或者地毯式分布，部分瘤体融合成较大肿瘤，中央可见坏死、溃疡，小鼠总瘤体数达百余枚。组织病理学示肿瘤高度增生，大量异型性细胞突破基底膜带弥漫全层，可见病理核分裂像及角化珠。（3）免疫学研究结果：ALA PLGA NPs PDT联合微针给药组和ALA-PDT组1次治疗结束后1d、3d、7d经免疫组化检测CD4~+T、CD8~+T表达逐渐增加，与治疗前相比，治疗后3d阳性细胞数明显增加（P＜0.05），其他组未见明显增加。ALA PLGA NPs PDT联合微针给药组与ALA-PDT组相比较差异无统计学意义（P＞0.05），与其他组比较有统计学意义（P＜0.05），CD4~+T/CD8~+T比值无明显变化。可见ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗SCC小鼠，能够增强局部免疫学效应。ALA PLGA NPs PDT联合微针给药组和ALA-PDT组1次治疗结束后1d、3d、7d经流式细胞术检测CD4~+T、CD8~+T均增加，3天达高峰，之后缓慢下降。TNF-α，IL-6，IL-10的表达随时间变化逐步增加，3天达高峰，之后缓慢下降，治疗后3d，TNF-α，IL-6，IL-10明显增加（P＜0.05）。其他组未见明显变化。ALA PLGA NPs PDT联合微针给药组与ALA-PDT组相比较差异无统计学意义（P＞0.05），与其他组比较均有统计学意义（P＜0.05）。可见ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗SCC小鼠，也能够增强系统免疫学效应。结论（1）ALA PLGA NPs联合微针给药增强了光敏剂ALA的稳定性、提高了ALA对小鼠皮肤SCC组织的靶向选择性、提高了SCC组织吸收ALA的效率、提高了PpⅨ的生成量；（2）ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗SKH-1小鼠皮肤鳞状细胞癌方法安全有效、不良反应少；（3）ALA PLGA NPs PDT联合微针给药治疗能够提高SCC小鼠的CD4~+、CD8~+百分比，显著改善血清IL-10、IL-6、TNF-α水平，能够增强治疗SCC小鼠的免疫学效应。

全文目录


目录  4-6
中文摘要  6-11
Abstract  11-18
英文缩略词表  18-19
前言  19-26
  参考文献  22-26
第一部分 ALA PLGA NPs PDT 联合微针给药治疗 SKH-1 成模小鼠的药代动力学研究  26-40
  1 引言  26-27
  2 材料与方法  27-29
  3 结果  29-37
  4 讨论  37-38
  5 结论  38-39
  6 参考文献  39-40
第二部分 ALA PLGA NPs PDT 联合微针给药治疗 SKH-1 小鼠皮肤鳞状细胞癌疗效研究  40-54
  1 引言  40
  2 材料与方法  40-43
  3 结果  43-51
  4 讨论  51-52
  5 结论  52
  6 参考文献  52-54
第三部分 ALA PLGA NPs PDT 联合微针给药治疗 SKH-1 小鼠皮肤鳞状细胞癌免疫学效应研究  54-72
  1 引言  54
  2 材料与方法  54-58
  3 结果  58-66
  4 讨论  66-69
  5 结论  69
  6 参考文献  69-72
附录  72-73
  本人简历  72
  学习和工作经历  72
  在学期间的研究成果目录  72-73
致谢  73-74
课题综述  74-81
  参考文献  78-81

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 皮肤肿瘤
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