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探讨广东汉族女性乳腺癌的EGFR信号通路主要基因及乳腺癌细胞中主要癌基因的突变情况

作　者: 佟琳
导　师: 叶长生
学　校: 南方医科大学
专　业: 普通外科学
关键词: 乳腺癌 EGFR通路乳腺癌细胞株基因突变
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景和目的：乳腺癌现已成为女性最常见的恶性肿瘤。2008年,全球乳腺癌新增病例约138万,占所有新发癌症病例的22.9%。在欧美国家,乳腺癌占女性恶性肿瘤的25%-30%。与西方发达国家相比,中国女性乳腺癌的发病率总体稍低,但随着经济和社会的飞速发展以及生活方式的西化中国乳腺癌发病率却逐年增长。2008年中国乳腺癌新发病例(16.9万)比2002年(12.6万)增长了34%,对女性的身心健康构成严重威胁。按照当前的趋势,预计到2021年,我国女性乳腺癌的发病率将达到85.3/100,000,乳腺癌已成为我国肿瘤防治计划实施重点之一。在过去的20年里,乳腺癌的治疗发展的非常迅速,因此也变得逐渐复杂。对乳腺癌的系统治疗包括手术治疗、化疗、内分泌治疗、放疗和分子靶向治疗,这同时需要对患者进行综合的评价和全面的分析。近几年,许多新生的分子靶向治疗药物逐渐发展起来,使得乳腺癌的治疗得到了极大的进展。许多学者努力探讨癌基因的功能及特点,基因突变可能导致癌基因的异常激活,从而增加了正常细胞向癌细胞转变的几率。最近研究显示30%的肿瘤组织存在着至少1中癌基因的突变。研究者们希望通过对恶性肿瘤细胞的突变的探索而开展更多的针对靶点基因的个体化治疗。逐渐对基因突变的认知,可以使我们突破治疗恶性肿瘤的瓶颈。完成这样一项任务需要大量的对癌症基因的特性信息,这些信息的累积便可以转化为靶向治疗的有力证据。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是乳腺癌靶向治疗的潜在靶点之一。EGFR基因编码的表皮生长因子受体是跨膜糖蛋白,属于蛋白激酶家族成员,其配体主要为表皮生长因子家族,能够实现对癌细胞的存活和增殖的调节。EGFR酪氨酸激酶抑制剂可以通过抑制活化的表皮生长因子受体,进而阻断癌症细胞增殖的主要动力,从而改善癌症病人的预后。EGFR酪氨酸激酶抑制剂包括拉帕替尼、吉非替尼和厄洛替尼,现在已经被广泛用于非小细胞肺癌和大肠癌。在肺癌、乳腺癌、大肠癌和胰腺癌等恶性肿瘤中都存在EGFR的过表达,但是抗EGFR的治疗在乳腺癌中却并没有十分突出的优势。在对非小细胞肺癌的研究中显示,存在EGFR突变的患者对抗EGFR的治疗较敏感。此外,关于EGFR在乳腺癌中的表达、突变情况的研究尚少,因此,目前对乳腺癌组织中EGFR突变情况的研究是十分必要的。除EGFR本身因素外,其下游信号转导通路中的其它成员与EGFR靶向治疗疗效的关系也倍受关注。PI3K/AKT和RAS/RAF是EGFR下游的两个主要通路,与EGFR相同,参与癌细胞的许多生理和病理过程,包括增殖、转移、抗细胞凋亡、血管生成和癌细胞浸润等。这两条通路的主要基因的突变情况的不同影响着基因靶向治疗后患者的获益情况。EGFR下游的PIK3CA、KRAS和BRAF基因作为耐药基因,以上基因的突变情况目前位列在奎斯特诊断结直肠癌的突变列表中(the Quest Diagnostics Colorectal Cancer Mutation Panel)。奎斯特报告显示,检测EGFR下游两个重要信号通路的主要基因(BRAF和KRAS)可以增加对直结肠癌对靶向药物的敏感性和是否耐药。然而,目前的对乳腺癌的治疗的指南中没有要求对这些基因的突变进行检测。因此,评估乳腺癌EGFR基因及其下游重要基因突变的情况以了解对乳腺癌的基因信息有进一步的了解并且可以为探索抗EGFR等靶向药物对乳腺癌作用,获益较少的原因。国外已有大量报道显示不同人群的乳腺癌的发生发展及病因规律存在差异。在全球乳腺癌患病率都在下降的大的背景下,中国乳腺癌发病率却仍成上升趋势,其间可能存在着中国女性乳腺癌与西方国家乳腺癌的异质性。许多对乳腺癌的临床病理特征的描述及分析都是基于西方女性的数据,对亚洲乳腺癌的病理特征的描述并不充分。此外,目前少量的对于乳腺癌在突变的研究,大多基于对白种人的研究,因此对于中国汉族乳腺癌患者不能完全适用。本研究对中国广东汉族女性乳腺癌的临床病理特征进行描述及分析,利用高准确率、高敏感性的Sequenom基因检测系统,对EGFR通路上主要基因的突变情况进行研究,以期增加对中国乳腺癌的了解。继对乳腺癌病例进行EGFR通路的主要基因的突变情况研究后,本研究对10种常用的乳腺癌细胞株,利用同样的方法,进行包括19个癌症相关基因上的238个重要突变位点的突变的检测,其中包括EGFR通路基因的多个位点。此项研究的目的是想通过对乳腺癌细胞株的重要癌基因及影响功能的突变位点进行筛查,为今后的靶向药物方面的研究提供实验依据。研究方法：1、收集2011年5月至2012年5月间于南方医院住院并经手术治疗,具备详细的临床资料并且保存有冰冻病理组织的乳腺癌病例120例,总结该120例病人在临床特征及病理指标等,并利用SPSS13.0软件进行相关统计分析各项指标间是否存在联系。2、利用Sequenom MassARRAY(?)-IPLEX检测平台进行突变的检测,检测基因为PIK3CA/AKT和RAS/RAF/MEK通路上的主要基因(AKT1、BRAF、EGFR、 HRAS、KRAS、NRAS和PIK3CA),选取了并非随意出现、但常在基因固定区域出现、影响基因功能的基因突变位点,这些位点在正常细胞癌变的过程中起重要作用或影响个体化治疗效果。宅ENCBI中dbSNP数据库中获得所挑选突变的SNPs位点所在的基因序列,使用引物设计软件Assay Designer4.1(Sequenom)进行引物设计。参照仪器说明进行基因突变位点的检测,通过自动和人工两种方式进行突变图像的分析。3、选取10种乳腺癌细胞株(MDA-MB-453、MDA-MB-468、MDA-MB-231、 MCF-7、T47D、BT474、BT549、HS578、ZR-75-1、SK-BR-3),采用了Sequenom公司出品的Oncocarta套组平台,其中包括19个癌症相关基因上的238个重要突变位点进行突变检测,方法同前。19个基因均为主要的癌症基因,这些位点均为影响功能的位点(gain-of-function point mutations)。结论：1、本研究对120病例乳腺癌患者的年龄、病理类型、临床分期、肿物大小、组织学分级、淋巴结转移情况、ER、PR、HER-2、KI-67表达情况进行统计并对各指标间的关系进行分析,发现ER和/或PR表达情况与HER-2的表达情况成负相关(P<0.05),KI67的表达情况与组织学分级之间的关系存在统计学意义(P<0.05),对其他各种指标的关系分析中未见明显统计学差异。2、在对120例乳腺癌的(AKT1、BRAF、EGFR、HRAS、KRAS、NARS、PIK3CA)突变检测中,有12个病例发生突变,共有13种突变。突变病例中有2例处在临床分期Ⅰ期,6例处在临床Ⅱ期,4例处在临床Ⅲ期。被检测的7个基因中,有EGFR、KRAS和PIK3CA,3个基因(42.9%)被检出存在突变。在检测的25种突变位点中,有6(24.0%)种突变被检出,其中3(50.0%)种突变类型在至少一个病例中被检测。其中有一个病例同时在KRAS和PIK3CA基因上存在突变。3、在10株乳腺癌细胞株中共发现有8个基因(ABL1、KIT、EGFR、HRAS、KRAS、 NRAS、PDGFRA、PIK3CA),18个突变位点,每个细胞株均存在突变位点。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-14
前言  14-16
第一节 120例乳腺癌临床病理分析  16-25
  1.1 病例的收集  16-17
  1.2 实验方法和步骤  17-20
  1.3 主要试剂及仪器  20-21
  1.4 统计  21
  1.5 结果  21-23
  1.6 讨论  23-25
第二节广东汉族女性乳腺癌在EGFR信号通路的主要基因突变情况  25-53
  2.1 研究背景  25-34
  2.2 材料与方法  34-43
  2.3 统计分析  43
  2.4 结果  43-45
  2.5 讨论  45-51
  2.6 小结  51-53
第三节乳腺癌细胞株在主要癌基因中的突变情况  53-64
  3.1 材料与方法  53-58
  3.2 结果  58-60
  3.3 讨论  60-64
参考文献  64-76
硕士论文发表情况  76-77
致谢  77-78

探讨广东汉族女性乳腺癌的EGFR信号通路主要基因及乳腺癌细胞中主要癌基因的突变情况

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