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急性T淋巴细胞白血病的细胞及分子遗传学研究

作　者: 王谦
导　师: 仇惠英；陈苏宁
学　校: 苏州大学
专　业: 内科学
关键词: 急性T淋巴细胞白血病细胞遗传学 PHF6 基因突变隐匿性重排细胞系
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:1、系统分析1997年至2011年在本实验室进行细胞遗传学检测的297例初诊急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)患者的临床、实验室及细胞遗传学特征。2、检测101例T-ALL患者中PHF6、NOTCH1、FBXW7、WT1基因突变以及64例T-ALL患者中SET-NUP214、SIL-TAL1、CALM-AF10融合基因重排的发生率,分析基因突变、染色体易位及隐匿性重排的相关性,阐述细胞和分子遗传学异常在T-ALL发生中的意义。3、我们建立了国际上第一株B淋系和髓系共表达的混合表型急性白血病细胞系JIH-5,并对其进行了较为完整的生物学鉴定。方法:1、297例T-ALL患者均采用骨髓细胞直接法或短期培养法制备染色体悬液,采用R显带进行核型分析,研究T-ALL患者中细胞遗传学的特点。2、应用聚合酶链反应(PCR)扩增基因组DNA及PCR产物双向测序的方法分析101例初诊T-ALL患者中PHF6、NOTCH1、FBXW7及WT1基因突变的发生率,同时采用巢式RT-PCR技术检测64例T-ALL患者中SET-NUP214、SIL-TAL1、CALM-AF10融合基因重排的发生率,综合分析基因突变与隐匿性重排对T-ALL患者临床特征及预后的影响。3、收集1例混合表型急性白血病患者第二次完全缓解后再次复发时的骨髓标本,应用淋巴细胞分离液常规分离单个核细胞,在20%胎牛血清+80%IMDM培养基内长期培养;同时对新建细胞系进行相关鉴定,采用瑞氏及过氧化物酶(POX)染色观察细胞形态学、电镜观察细胞超微结构、苔盼蓝染色绘制生长曲线、流式细胞仪分析免疫表型、R带分析染色体核型、PCR方法检测EB病毒感染及支原体污染、STR-PCR检测患者原代白血病细胞是否来自同一个体、集落形成能力的检测,同时对JIH-5细胞系在裸鼠体内的致瘤性进行了研究。结果1、单中心297例初诊T-ALL患者的临床、实验室及细胞遗传学特征297例T-ALL患者中,男性218例,女性79例,男女比例为2.76:1,中位年龄23(4-76)岁,儿童114例,成人183例。按FAB诊断标准,297例T-ALL患者中L1型112例,L2型94例,未分类型(NOS)91例。三组病例的临床和实验室资料统计分析后发现,在发病年龄方面,L2<L1<NOS(21.5<22<33岁),NOS组患者中位年龄显著大于L1和L2组(P<0.05);在中位白细胞(WBC)计数方面, L1>L2>NOS(88.4>40.4>22.4×109/L),L1组患者的中位WBC计数明显高于L2组和NOS组;在中位血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)、乳酸脱氢酶(LDH)水平方面,三组之间均无统计学差异。297例T-ALL患者中,96.9%(288/297)的患者染色体核型分析成功,其中异常核型检出率为42.4%。T-ALL异常核型检出率及再现性异常发生率比较低,本组中出现≥2次的结构性异常有2p-,5q-,6q-,i(7q),9p-,9q-,der(11),12p-,12q-,13q-, 13q+,14q+,i(17q),t(11;14)(p13;q11),t(4;11)(q21;p15),t(9;22)(q34;q11),t(2;14)(p15;q32),t(1;19)(q23;p13.3)。本组中亚二倍体检出率为3.5%,47-50条的超二倍体检出率为9.4%,>50条的超二倍体检出率更低,为1.4%,四倍体检出率为1.7%。2、T-ALL患者中常见基因突变及隐匿性重排的临床和实验室特征101例T-ALL患者均进行常见基因突变检测,中位年龄23(7-56)岁,男女性别比为4.3:1。101例患者中有14例(13.9%)存在PHF6基因突变,其中无义突变6例,移码突变5例,错义突变3例。PHF6基因突变集中发生于外显子8、9、10,有4例突变发生在PHD锌指结构域。101例T-ALL患者中50例(49.5%)发生NOTCH1基因突变,涉及到HD结构域的突变有31例,占30.7%,其中错义突变20例,移码突变11例;涉及到PEST结构域的突变有12例,占11.8%,均为移码突变;涉及到TAD区域的突变有1例,占1.0%,为插入突变;涉及到HD+PEST区域的有5例,占5.0%;涉及到HD+TAD区域的突变有1例,占1.0%。101例T-ALL患者中有10例发生FBXW7突变,突变率为9.9%,其中9例累及到9号外显子,点突变5例,插入和缺失突变4例;1例累及到10号外显子,为点突变。同时伴有FBXW7和NOTCH1基因突变的有7例。101例T-ALL患者中有4例存在WT1基因突变,突变率为4.0%,其中3例突变累及7号外显子,均为插入和缺失突变;1例点突变累及9号外显子突变。64例T-ALL患者中有5例检测到SET-NUP214融合基因转录本,发生率为7.8%,中位年龄为27(20-56)岁,男女性别比为4:1。有12例T-ALL患者检测到SIL-TAL1融合基因转录本,发生率为18.8%,中位年龄为15(7-42)岁,男女性别比为3:1。SIL-TAL1融合基因在成人T-ALL患者中的发生率为5.1%,在儿童T-ALL患者中的发生率为40%,两者之间具有明显的统计学差异(P=0.002)。64例T-ALL患者中均未检测到CALM-AF10融合基因转录本,发生率为0%。其中62例核型分析成功的T-ALL患者中有30例检出染色体异常,在32例核型正常的患者中有10例存在隐匿性染色体重排。PHF6突变型(PHF6-mut)与野生型(PHF6-wt)患者相比较,前者外周血WBC计数较低(P<0.05),PLT计数较高(P<0.05),LDH水平较低(P<0.05),骨髓原始细胞比例较高(P<0.05),两组的Hb水平、性别比没有统计学差异。FBXW7-mut组与FBXW7-wt组患者相比较,前者外周血PLT计数较低(P<0.05),两组的WBC、Hb、LDH、骨髓原始细胞比例、性别比方面没有统计学意义。SET-NUP214阳性组WBC计数明显低于阴性组(P<0.05),两组在PLT计数、Hb水平、LDH水平、骨髓原始细胞比例、性别比方面的差异无统计学意义。NOTCH1-mut组及NOTCH1-wt组、WT1-mut组及WT1-wt组、SIL-TAL1阳性组及阴性组在性别比、WBC计数、Hb水平、LDH水平、骨髓原始细胞比例方面的差异均无统计学意义。PHF6基因突变在成人患者中的发生率为19.4%,在儿童患者中的发生率为5.1%,两者具有显著差异(P<0.05)。SIL-TAL1阳性组在儿童中的发生率明显高于阴性组(P<0.05)。PHF6基因突变与NOTCH1、JAK1基因突变、SET-NUP214融合基因重排密切相关(P<0.01)。儿童T-ALL患者完全缓解(CR)率明显高于成人T-ALL患者(85.2% vs 60.5%,P<0.05),PHF6-mut组中位无复发生存期明显短于PHF6-wt组(11 vs 24.8个月,P<0.05)。PHF6-mut组及PHF6-wt组、NOTCH1-mut组及NOTCH-wt组、FBXW7-mut组及FBXW7-wt组、WT1-mut组及WT1-wt组、SET-NUP214阳性组与阴性组、SIL-TAL1阳性组与阴性组在CR率、总生存期方面的差异均无统计学意义(P>0.05)。3、混合表型急性白血病细胞系JIH-5的建立和鉴定JIH-5细胞在液体培养中呈单细胞样悬浮生长,目前已于体外持续培养16月余,状态良好,经液氮或-80℃低温冰箱冻存、复苏后仍能持续增殖,但增殖较缓慢,其倍增时间约为97小时。JIH-5细胞瑞氏染色下胞体圆形,形态规则,胞核为圆形或类圆形,偶见折叠、凹陷,核染色质细致,部分可见核仁,胞浆量少至中等,染蓝色,多不见颗粒,POX染色为阴性。电镜观察JIH-5细胞呈椭圆形,细胞表面有短小微绒毛,细胞质内可见丰富的线粒体、内质网、溶酶体等细胞器及空泡结构,胞核不规则,部分细胞可见核凹陷,多可见明显的核仁。JIH-5细胞表达CD10、CD19、CD22、CD79a、CD13、CD33、CD15、MPO及CD41抗原,呈B淋系/髓系抗原表达,也有部分巨核系抗原表达。经PCR检测无EB病毒及支原体感染,STR-PCR示JIH-5细胞系来源于患者骨髓细胞,核型分析结果显示JIH-5细胞保留了原代白血病细胞的染色体改变t(12;22)(p13;q11),同时也出现了新的异常如t(2;2)(q33;q37)等染色体易位。JIH-5细胞能在半甲基纤维素中形成集落,在裸小鼠体内也具有一定的致瘤性。结论1、本组297例T-ALL患者中,核型异常率为42.4%,最常见的染色体结构异常累及14q11,检出率为6.3%,其次是del(6q),检出率4.5%,t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL1检出率为2.4%。通过隐匿性染色体重排的检测,提高了核型异常的检出率。2、PHF6基因突变是T-ALL中一类再现性遗传学异常,突变组患者中位无复发时间明显短于未突变组;NOTCH1基因突变是T-ALL患者中最常见的突变;FBXW7、WT1基因突变发生率明显低于国外报道。3、本研究首次发现PHF6基因突变与NOTCH1、JAK1基因突变以及SET-NUP214融合基因重排存在明显的相关性,为研究T-ALL中基因之间的协同作用提供了理论依据。4、我们建立了国际上第一株B淋系和髓系共表达的混合表型急性白血病细胞系JIH-5,同时进行了较为完善的生物学鉴定,为该类疾病的进一步研究提供了有力的工具。

急性T淋巴细胞白血病的细胞及分子遗传学研究

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