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一个遗传性血管性血友病家系的实验室诊断和分子发病机制研究

作 者: 董静
导 师: 董宁征
学 校: 苏州大学
专 业:
关键词: 血管性血友病因子 血管性血友病 基因突变
分类号: R554.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


血管性血友病(von Willebrand disease, vWD)是由于血管性血友病因子(von Willebrand fcator, VWF)缺乏或功能异常所致的出血性疾病。根据发病原因分为遗传性和获得性两大类。遗传性血管性血友病主要为常染色体显性遗传,少数为隐性遗传。遗传性vWD的不同分类及亚型分型具有不同的分子发病机制。研究该病的分子发病机制,有助于了解VWF蛋白的结构与功能的关系,对于临床诊断、治疗和预后都有重要的意义。目的:采用一系列vWD诊断实验、分型实验,对一个出血性疾病患者及其家系明确诊断,并对先证者及家系受累成员的血管性血友病因子(VWF)基因进行分析,探讨其发病机制。方法:一)应用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、瑞斯托霉素诱导的血小板聚集实验(Ristocetin Induced Platelet Aggregation,RIPA)及VWF多聚体电泳等方法分析vWD患者家系三代6位成员临床表型。二)PCR扩增先证者及家系成员的VWF基因的52个外显子及其侧翼序列并测序,通过Chromas软件将测序结果与NM000552.3序列进行比对。根据检测到的突变位点,以含VWF全长cDNA的表达质粒(pSVVWF)为模板,采用定点突变的方法构建突变质粒pSVVWFdel6。将野生型VWF质粒(wt-pSVVWF)和突变型VWF质粒(pSVVWFdel6)转染HEK293细胞。收集瞬时转染后的上清和细胞裂解液。转染后的上清以40倍的比例浓缩。ELISA法检测细胞上清及细胞裂解液中VWF抗原含量,并采用多聚体电泳法对细胞上清进行VWF多聚体分析。结果:1、先证者的血浆VWF:Ag为20.5%,血浆FVIII:C为25.0%,VWF:RCo为6.2%,RIPA为28.5%,VWF:CB为3.8%,以上结果均明显低于正常参考值。血浆VWF多聚体分析显示大分子量多聚体缺乏,而血小板VWF多聚体分析无异常。同时先证者VWF:Ag/VWF:CB>2,这与以往报道相一致。2、与先证者有相似症状的四位家系成员的血浆VWF:Ag、VWF:RCo、FVIII:C、RIPA、VWF:CB均明显低于正常范围,同时血浆VWF多聚体分析显示大分子量多聚体缺乏,血小板VWF多聚体分析无异常。3、先证者的VWF基因52个外显子及其侧翼序列扩增测序,发现第28号外显子存在杂合的6个碱基GATGTG的缺失,导致VWF A2区的氨基酸D1529-V1530缺失,其四位受累家系成员测序结果也有相同的基因的改变。为确定所发现的VWF基因缺失这一改变属基因突变还是基因多态性,我们共检测了68位正常人的VWF基因的第28号外显子基因,未见该基因改变。4、野生型及突变型VWF表达载体转染HEK293细胞后,检测细胞裂解液中VWF抗原含量,突变型与野生型无明显差异;而细胞培养上清中,单转突变体的细胞上清VWF含量显著降低,约为野生型的26.89±4.64%,共转突变型和野生型的细胞上清中VWF含量也显著降低,为野生型的37.83±5.29%,VWF多聚体分析突变型浓缩上清中VWF大分子量多聚体缺如。结论:1、根据先证者及受累家系成员临床症状、体征以及VWF相关实验室检查,可明确诊断为2A型vWD。2、基因分析发现先证者及其他4位家系成员的VWF A2结构域内一杂合的6个碱基GATGTG的缺失,从而导致氨基酸D1529-V1530缺失,该突变国内外未见报道,为新发现的基因突变。3、体外细胞水平研究提示,VWF D1529-V1530缺失影响VWF的多聚化及分泌,从而影响VWF的功能,为该家系的分子发病机制。

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 血液及淋巴系疾病 > 血液疾病 > 出血性疾病 > 血友病
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