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OLFM4在胃癌细胞增殖及H_2O_2与TNFα诱导的细胞凋亡调控中的作用研究

作　者: 刘瑞华
导　师: 向华
学　校: 重庆医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 胃癌 OLFM4 RNA 干扰细胞增殖凋亡抵制
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：人olfactomedin4(OLFM4)基因又称抗凋亡分子GW112,在多种肿瘤中高表达，并且在胃癌发生发展中起着非常重要的作用。虽然在许多研究中表明了OLFM4对细胞增殖和凋亡作用的功能，但是最近的研究却显示此作用具有细胞和组织特异性。本研究主要探讨胃癌中高特异表达分子OLFM4在细胞增殖调控及凋亡抵制中的作用。方法：比较OLFM4蛋白在各种胃癌细胞中的表达模式，选取OLFM4高表达的胃癌细胞株。构建靶向抑制OLFM4基因的短发夹双链RNA（shRNA）干扰质粒（pGenesil1.1-siOLFM4）和阴性对照质粒（pGenesil1.1-HK），经DNA测序鉴定正确后，将干扰质粒和阴性对照质粒分别转染胃癌SGC-7901和MKN-45细胞，G418抗性筛选得到稳定单克隆细胞株。RT-PCR和Western blot分别检测OLFM4mRNA和蛋白表达。采用WST-1实验检测OLFM4调控细胞增殖能力，克隆形成实验检测OLFM4干预后细胞克隆形成能力，FCM检测细胞周期变化和细胞凋亡。将筛选得到的单克隆细胞进行裸鼠皮下注射，建立胃癌裸鼠移植瘤生长模型，分析细胞致瘤性，绘制肿瘤生长曲线，测定肿瘤体积和体重，RT-PCR及免疫组织化学检测肿瘤组织中OLFM4mRNA及蛋白表达。此外，体外实验检测caspase-3,9活性，在caspase抑制剂Z-VAD-fmk存在与否的情况下评估OLFM4在H2O2与TNFα对细胞凋亡和caspase-3活性的影响。结果：经DNA测序成功构建干扰质粒pGenesil1.1-siOLFM4和阴性对照质粒pGenesil1.1-HK。G418筛选得到单克隆细胞株荧光率高达95%，RT-PCR和Western blot结果显示，与阴性对照组相比，OLFM4敲减后细胞中OLFM4mRNA和蛋白表达明显降低（P<0.01）；WST-1实验和克隆形成实验显示，SGC-7901和MKN-45细胞敲减OLFM4后，细胞增殖能力受到明显抑制。FCM结果显示，两种胃癌细胞均阻滞在G1期（P<0.01）。体内致瘤性研究显示，干扰组最终皮下瘤体大小明显小于阴性组（P<0.01）。与阴性组相比，两种细胞干扰组致瘤性抑制率分别为40.29%和37.48%。OLFM4敲低不能诱导明显的细胞凋亡，但能促进H2O2与TNFα诱导的细胞凋亡和caspase-3活化（P<0.01）。caspase抑制剂Z-VAD-fmk处理后能衰减caspase-3活化且能逆转H2O2与TNFα诱导的细胞凋亡（P<0.01）。结论：OLFM4敲减后能明显抑制胃癌细胞SGC-7901和MKN-45的致瘤性。敲减OLFM4激活了caspase-3依赖细胞凋亡途径，并增强了胃癌细胞对H2O2与TNFα治疗的敏感性。抑制OLFM4基因表达和抗癌药物的联合应用可能成为胃癌干预的潜在的治疗策略。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-14
第一部分 OLFM4敲减细胞模型的建立及鉴定  14-27
  1 材料与方法  14-22
  2 结果  22-26
  3 讨论  26-27
第二部分 OLFM4 在胃癌细胞增殖调控中的作用研究  27-39
  1 材料和方法  27-31
  2 结果  31-37
  3 讨论  37-39
第三部分 OLFM4对H_2O_2与TNFα诱导的细胞凋亡的作用研究  39-46
  1 材料和方法  39-40
  2 结果  40-44
  3 讨论  44-46
全文总结  46-47
参考文献  47-50
文献综述 OLFM4的作用研究进展  50-58
  参考文献  55-58
致谢  58-59
攻读硕士期间发表的学术论文及参与的课题  59-60

OLFM4在胃癌细胞增殖及H_2O_2与TNFα诱导的细胞凋亡调控中的作用研究

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