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过继转输T淋巴细胞来源exosomes诱导妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受的研究

作　者: 张斯斯
导　师: 郝淑维; 崔澂
学　校: 河北医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 妊娠丢失 过继转输 T淋巴细胞 exosomes 免疫耐受 小鼠
分类号: R714.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 12次
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内容摘要


目的：反复妊娠丢失是指连续三次或以上发生在孕20周前的妊娠丢失，是一种严重危害孕妇身心健康的产科疾病。正常妊娠相当于半同种异体移植过程，孕妇对半同种异体胚胎抗原不产生排斥反而产生保护性免疫耐受。因此，控制母体对胚胎抗原的免疫反应是介导母胎免疫耐受的重要手段。目前临床常采用免疫细胞过继疗法治疗不明原因反复妊娠丢失（URSA），诱导受孕母体对半同种异体胚胎抗原的有效免疫耐受。但此种方法尚存在制备不规范、疗效不稳定等缺陷，限制了临床推广使用。本研究采用实验动物模型，比较研究T细胞来源的非细胞成分exosomes与细胞成分过继转输对妊娠丢失孕鼠胚胎发育、外周及胎盘局部免疫微环境的影响，旨在探讨T细胞来源exosomes作为非细胞成分取代传统细胞疗法的可行性，为机体免疫耐受的诱导及反复妊娠丢失的免疫治疗研究开辟新思路。方法：1雄性无关个体脾细胞及其exosomes的制备和初步鉴定：处死BALB/c雄鼠，无菌解剖取脾，获得单个细胞悬液后与刀豆蛋白A（ConA）共同孵育72h，光镜下观察并计算淋巴细胞转化率，噻唑蓝（MTT）染色法检测A492值。采用蔗糖密度梯度离心联合超滤技术获得exosomes；扫描、透射电镜观察exosomes的形态及结构，紫外分光光度法测定蛋白含量。2建立妊娠丢失动物模型及实验分组：独立饲养未合笼的CBA/J雌鼠为未孕对照组（Non-pregnancy组）。将雌雄小鼠随机分组后按2:1合笼交配；CBA/J（♀）×BALB/c（♂）为正常妊娠对照动物模型（Control组），CBA/J（♀）×DBA/2（♂）为URSA实验动物模型。再将URSA孕鼠随机分为妊娠丢失组（URSA组，孕第4天着床期尾静脉注射生理盐水）、细胞治疗组（CellularTherapy组，孕第4天尾静脉注射无关个体BALB/c雄鼠脾细胞）、非细胞治疗组（Non-cellular Therapy组，孕第4天尾静脉注射无关个体BALB/c雄鼠脾T淋巴细胞来源的exosomes）。3观察胚胎发育情况：将各组CBA/J孕鼠于妊娠第14天分别处死，无菌条件下解剖胎盘组织，测量后计算胎盘组织体积，将各组吸收胚胎、存活胚胎分别计数，计算胚胎吸收率及妊娠丢失率。4检测孕鼠外周T淋巴细胞免疫功能：将各组CBA/J孕鼠于妊娠第14天分别处死，无菌条件下解剖取脾，制备脾单个细胞悬液。MTT染色法检测ConA诱导T细胞转化的A492值；细胞破膜处理，直接荧光标记流式细胞计数（FCM）分别检测Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2以及Th2型细胞因子IL-4、IL-10的表达。5分析孕鼠母胎界面免疫抑制状况：各组CBA/J孕鼠于妊娠第14天分别处死，无菌条件下解剖胎盘组织，制备石蜡包埋切片。HE染色，光镜下分别以矩形走形计数200个免疫细胞，计算大颗粒淋巴细胞（LGL）、小淋巴细胞、巨噬细胞（Mφ）等各类免疫细胞的百分率。免疫组化染色、图像分析，免疫抑制分子TGF-β1、IL-10、COX-2等表达强度以灰度值（GS）表示，GS值大小与阳性表达强度反相关；以矩形走形计数200个细胞，分别计算各组阳性细胞表达百分率。6统计学处理：各组数据均通过SPSS13.0版本软件检验正态性、方差齐，采用卡方检验比较各组孕鼠胚胎发育情况、母胎界面免疫细胞表达情况；采用F检验对孕鼠T细胞免疫功能、胎盘免疫抑制分子的表达进行单因素方差分析（ANOVA），S-N-K法进一步对多个样本均数间进行两两比较。显著性检验水准α=0.05。结果：1雄性无关个体脾脏T淋巴细胞来源Exosomes的初步鉴定1.1雄性无关个体脾脏淋巴细胞转化情况光镜下观察雄性无关个体脾脏淋巴细胞转化率为78.25%±3.50%（n=10）；MTT法检测无ConA对照组、转化实验组A492值分别为0.249±0.073、1.032±0.064（n=10, P<0.01）。1.2形态及超微结构观察扫描及透射电镜下观察可见，T细胞来源exosomes为脂质双层膜包围的球体，呈圆形或椭圆形杯口状，有完整胞膜，直径约30nm～100nm，内为低电子密度物质。1.3蛋白定量紫外分光光度法蛋白定量显示exosomes的A280值为0.343±0.029。2不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响正常妊娠对照动物模型（Control组）孕鼠的胚胎吸收率为5.26%，妊娠丢失组（URSA组）为28.57%，过继转输无关雄鼠细胞治疗组、T细胞来源exosomes的非细胞治疗组分别为8.47%、3.59%。与未经治疗的URSA组相比，细胞及非细胞治疗组胚胎吸收率均显著下降（均P<0.01），且均下降至Control组水平（均P>0.05）；非细胞治疗组胚胎吸收率显著低于细胞治疗组（P<0.05）。Control组孕鼠的妊娠丢失率为20%，URSA组为52%，细胞治疗组、非细胞治疗组分别为20%、16%。与未经治疗的URSA组相比，细胞及非细胞治疗组妊娠丢失率均显著下降（均P<0.01），且均下降至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显差异（P>0.05）。3不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠外周T细胞免疫功能的影响3.1检测ConA诱导T淋巴细胞转化功能未经ConA诱导转化时，与未孕CBA/J雌鼠脾细胞培养72h后A492值（0.195±0.136）相比较，Control组、URSA组及细胞治疗组、非细胞治疗组孕鼠脾细胞的A492值均显著升高（分别为0.794±0.283、0.812±0.268，0.507±0.114、0.341±0.125，均P<0.05）。其中，Control组与URSA组之间无明显差异（P>0.05）；细胞治疗组、非细胞治疗组较之显著下调（均P<0.05），且非细胞治疗组显著低于细胞治疗组（P<0.05）。经ConA诱导转化后，与未孕CBA/J雌鼠脾细胞转化A492值（1.352±0.315）相比较，Control组、URSA组及细胞治疗组、非细胞治疗组孕鼠脾细胞转化均显著下降（分别为1.009±0.266、1.016±0.205、0.739±0.214、0.509±0.173，均P<0.05）。Control组与URSA组之间无明显差异（P>0.05）；细胞治疗组、非细胞治疗组较之显著下调（均P<0.05），且非细胞治疗组显著低于细胞治疗组（P<0.05）。3.2检测外周Th1/Th2细胞功能3.2.1Th1型细胞因子的表达与Control组脾细胞IFN-γ表达百分率（7.48%±0.87%）相比，URSA组表达百分率显著升高（12.22%±0.91%，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显著降低（分别为6.94%±0.97%、6.40%±1.27%，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。与Control组脾细胞IL-2表达百分率（6.40%±0.77%）相比，URSA组表达百分率显著升高（18.90%±1.68%，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显著降低（分别为7.20%±1.04%、6.36±0.62%，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。3.2.2Th2型细胞因子的表达与Control组脾细胞IL-4表达百分率（9.26%±0.88%）相比，URSA组表达百分率显著降低（5.82%±0.67%，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显著升高（分别为8.22%±1.11%、9.98%±1.48%，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；非细胞治疗组显著高于细胞治疗组（P<0.05）。与Control组脾细胞IL-10表达百分率（7.10%±1.07%）相比，URSA组表达百分率显著降低（3.98%±0.60%，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显著升高（分别为5.80±0.85%、8.22±1.74%，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；非细胞治疗组显著高于细胞治疗组（P<0.05）。4不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胎盘局部免疫抑制状态的影响4.1分析胎盘组织中免疫细胞的种类及数量各组孕鼠胎盘绒毛中均散在可见大颗粒淋巴细胞（LGL）、小淋巴细胞、巨噬细胞（Mφ）等免疫细胞。Control组各类细胞百分率分别为66.00%±2.97%、15.06%±3.27%、17.52%±3.17%， URSA组分别为64.06%±2.86%、12.04%±3.18%、20.16%±4.40%，细胞治疗组分别为65.56%±2.77%、14.00%±2.80%、19.42%±3.90%，非细胞治疗组分别为66.02%±2.82%、14.60%±3.33%、18.14%±3.04%，各组间均无明显差异（均P>0.05）。各组总淋巴细胞百分率分别为81.06%±6.30%、76.10%±5.34%、79.56%±4.61%、80.62%±2.35%，相互之间均无明显统计学意义（均P>0.05）。4.2分析母胎界面免疫抑制分子的表达TGF-β1、IL-10、COX-2均可呈散在或片状形式阳性表达于各组胎盘滋养细胞、血管内皮细胞及免疫细胞胞浆中。4.2.1TGF-β1表达分析与Control组孕鼠胎盘组织中TGF-β1阳性细胞表达率（72.46%±11.40%）相比， URSA组阳性细胞表达率显著降低（46.31%±11.52%，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显著回升（分别为70.02%±7.34%，72.04%±6.08%，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。与Control组孕鼠胎盘组织中TGF-β1表达强度（74.36±2.51）相比，URSA组表达强度显著降低（94.00±3.32，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显著回升（分别为76.20±3.79、74.52±2.38，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。4.2.2IL-10表达分析与Control组孕鼠胎盘组织中IL-10阳性细胞表达率（69.30%±6.21%）相比，URSA组阳性细胞表达率显著降低（43.12%±7.40%，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显著回升（分别为65.32%±8.22%、68.98%±7.15，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。与Control组孕鼠胎盘组织中IL-10表达强度（90.60±4.16）相比，URSA组表达强度显著降低（120.04±4.58，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显著回升（分别为92.96±3.38、90.32±4.22，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。4.2.3COX-2表达分析与Control组孕鼠胎盘组织中COX-2阳性细胞表达率（82.34%±3.90%）相比，URSA组、非细胞治疗组阳性细胞表达率显著降低（分别为44.84%±5.78%、48.24±7.55%，均P<0.01），两组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）；经细胞治疗后表达百分率较URSA组显著回升（77.78%±4.78%，P<0.01），可回升至Control组水平（均P>0.05）。与Control组孕鼠胎盘组织中COX-2表达强度（82.12±3.70%）相比，URSA组表达强度显著降低（97.80±4.94，P<0.01）；经细胞治疗、非细胞治疗后显著回升（分别为83.28±4.44、82.40±6.64，均P<0.01）至Control组水平（均P>0.05）；两治疗组组间比较无明显统计学意义（P>0.05）。结论：1过继转输雄性个体外周淋巴细胞或其非细胞成分exosomes均可有效诱导母胎免疫耐受，有利于妊娠的正常进行。2过继转输雄性个体淋巴细胞分泌的非细胞成分exosomes可发挥较过继转输淋巴细胞更强的母胎免疫耐受诱导效应。3雄性个体外周淋巴细胞及其分泌的非细胞成分exosomes均可通过共同或相似的作用途径引发母体Th2偏移、胎盘适度的局部免疫抑制，有效诱导母胎免疫耐受。4雄性个体T细胞来源的非细胞成分exosomes可作为有效诱导母胎免疫耐受的生物学制剂，有望取代传统淋巴细胞过继免疫治疗。

全文目录


中文摘要  4-10
英文摘要  10-18
前言  18-19
材料与方法  19-25
结果  25-29
附图  29-44
附表  44-47
讨论  47-50
结论  50-51
参考文献  51-54
综述 T淋巴细胞介导的母胎免疫耐受与反复妊娠丢失免疫学发病机制之间关系的研究进展  54-65
  参考文献  60-65
致谢  65-66
个人简历  66

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中图分类: > 医药、卫生 > 妇产科学 > 产科学 > 病理妊娠（异常妊娠）
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