学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

抗WSSV-VP37结合蛋白单克隆抗体的研制及其初步应用

作　者: 迟妍妍
导　师: 战文斌
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 白斑症病毒 VP37结合蛋白单克隆抗体凡纳滨对虾鳃细胞膜
分类号: S945
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 18次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

白斑症病毒(WSSV)病是危害对虾养殖业健康发展的主要疾病之一,自1993年暴发以来,国内外学者纷纷对其开展研究。由于病毒粘附蛋白与宿主细胞受体的结合是病毒感染的起始与关键环节,因此,从分子水平上研究WSSV的粘附蛋白及其在宿主细胞表面的结合蛋白,对于弄清WSSV感染机理、探索防治途径具有关键意义。VP37是WSSV的主要囊膜蛋白之一,据报道其抗体具有病毒中和效果,它可能是WSSV一个重要的粘附蛋白。本论文对VP37进行了原核重组表达,利用VOPBA技术鉴定了重组VP37(rVP37)在凡纳滨对虾鳃细胞膜上的结合蛋白,对其纯化后经质谱鉴定为F1ATP合成酶β亚基(β-F1ATPase);用纯化的VP37结合蛋白免疫小鼠,制备了抗VP37结合蛋白的单克隆抗体;研究了该单抗与不同对虾鳃组织的免疫反应,并利用该单抗开展了WSSV与宿主细胞体外结合的阻断研究。具体研究内容与结果如下:(1)VP37结合蛋白的提纯与鉴定。本实验扩增了VP37编码基因,全长843 bp,构建了融合表达载体PET32a-VP37,转入大肠杆菌后成功表达,获得分子量为52 kDa的rVP37蛋白。利用差速离心法提取了凡纳滨对虾的鳃细胞膜蛋白,经VOPBA鉴定了rVP37在凡纳滨对虾鳃细胞膜上的结合蛋白,结果显示rVP37能与凡纳滨对虾鳃细胞膜上1条分子量为53 kDa的蛋白带结合。经切胶、电泳洗脱纯化该目的蛋白,质谱鉴定其为β-F1ATPase。(2)抗VP37结合蛋白单克隆抗体的研制。将纯化的VP37结合蛋白为抗原,免疫Balb/C小鼠,细胞融合后,通过间接ELISA法筛选分泌抗VP37结合蛋白的阳性杂交瘤,并采用有限稀释法克隆获得了6株稳定分泌抗VP37结合蛋白的单抗(1A5、1D5、1H5、1E8、2H4和2G5);经间接免疫荧光实验(IIFA)和免疫印迹实验(Western-blot)对该单抗的特性进行分析。IIFA结果显示各株单抗均能与凡纳滨对虾鳃组织发生特异性的荧光反应;Western-blot显示各株单抗均能与凡纳滨对虾鳃细胞膜上分子量为53 kDa左右的蛋白发生特异性结合。抗体类型分析表明:单抗1A5、1H5、1E8、2H4和2G5属IgG类;单抗1D5属IgM类。(3)抗VP37结合蛋白单克隆抗体的初步应用。通过IIFA检测单抗与中国对虾、斑节对虾和日本对虾的鳃组织的免疫反应,发现抗凡纳滨对虾鳃细胞膜上VP37结合蛋白单抗均能与这三种对虾的鳃组织发生交叉反应,说明这些WSSV易感对虾的鳃细胞上存在着与凡纳滨对虾鳃细胞膜上VP37结合蛋白相同的抗原表位。进而,利用该抗体开展了WSSV与凡纳滨对虾鳃细胞膜体外结合的阻断研究,阻断ELISA结果显示单抗1E8、1H5和2H4能够部分抑制WSSV与凡纳滨对虾鳃细胞膜的结合,暗示了VP37结合蛋白β-F1ATPase可能在WSSV感染凡纳滨对虾的过程中起重要作用。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
1 前言  10-25
  1.1 白斑症病毒的研究进展  10-19
  1.2 病毒受体的研究进展  19-25
2 凡纳滨对虾鳃细胞膜上VP37 结合蛋白的提纯与鉴定  25-41
  2.1 WSSV 和凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白的提取  26-30
  2.2 VP37 的表达与纯化  30-34
  2.3 VOPBA 技术鉴定凡纳滨对虾鳃细胞膜上VP37 结合蛋白  34-36
  2.4 VP37 结合蛋白的纯化及质谱鉴定  36-41
3 抗VP37 结合蛋白单克隆抗体的研制  41-53
  3.1 抗VP37 结合蛋白单克隆抗体的制备  42-44
  3.2 抗VP37 结合蛋白单克隆抗体的筛选及特性分析  44-50
  3.3 抗VP37 结合蛋白单克隆抗体的类型鉴定及纯化  50-53
4 抗VP37 结合蛋白单克隆抗体应用的初步研究  53-60
  4.1 抗VP37 结合蛋白单克隆抗体与三种对虾鳃组织的免疫反应  53-56
  4.2 抗VP37 结合蛋白单克隆抗体对WSSV 的体外阻断实验  56-60
总结  60-61
参考文献  61-70
附录  70-72
致谢  72

抗WSSV-VP37结合蛋白单克隆抗体的研制及其初步应用

内容摘要

全文目录

相似论文