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Her2靶向的小RNA药物输送系统治疗乳腺癌的研究

作　者: 窦双
导　师: 王均
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 细胞生物学
关键词: RNA干扰 siRNA 癌症治疗 药物输送系统 Her2 融合蛋白纳米技术
分类号: R737.9
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,已成为当今女性的“第一杀手”。临床上常用的外科手术以及放疗、化疗等手段均面临诸多问题。小干扰RNA(siRNA)药物是近年来兴起的一种新型药物,为目前多种束手无策的疾病如乳腺癌等的治疗带来了新的曙光。然而,制约siRNA药物发展的最关键因素是它的给药系统,特别是发展靶向特异输送siRNA药物到达癌细胞和癌组织的技术；解决该问题的关键是发展能克服siRNA系统给药的屏障,以及将siRNA药物特异高效输送到癌组织和癌细胞的靶向给药系统。大量研究表明约有25%-30%乳腺癌患者的癌细胞表面人类生长因子受体2(human growth factor receptors2,Her2)过度表达。本论文利用Her2单链片段抗体既具有抗原亲和活性,又具有分子小、易穿透细胞外间隙到达深部的肿瘤细胞的特点,构建了Her2靶向的小干扰RNA药物输送系统,高效地将siRNA输送到Her2阳性乳腺癌,抑制Her2阳性乳腺癌的生长。第一部分：制备了可与乳腺癌细胞表面高表达Her2受体特异性结合的Her2单链片段抗体融合蛋白,包括Her2单链片段抗体鱼精多肽融合蛋白和易化学键合的Her2单链片段抗体。上述融合蛋白均在大肠杆菌中成功表达,并利用Ni-NTA与融合蛋白上的His-tag结合,得到了纯度较高的目的蛋白。第二部分：利用了Her2单链片段抗体鱼精多肽融合蛋白结合siRNA,将siRNA靶向输送到Her2阳性乳腺癌细胞,并抑制了Her2阳性乳腺癌的生长。以DNMTs基因为靶基因,通过该融合蛋白靶向输送siDNMTs到Her2阳性的BT474细胞,有效沉默了目的基因DNMTs的表达,使抑癌基因RASSF1A的启动子区发生去甲基化而被再次激活,从而抑制肿瘤细胞的增殖。经尾静脉注射融合蛋白与siDNMTs的复合物,显著抑制了裸鼠原位植入Her2阳性乳腺癌的增殖。第三部分：在聚乙二醇-聚乳酸嵌段聚合物为主要材料的siRNA内米给药系统的基础上,通过Her2单链片段抗体的修饰,获得了靶向输送siRNA到Her2阳性乳腺癌的纳米给药系统,促进了Her2日性乳腺癌细胞对siRNA的摄取。经Her2单链片段抗体修饰的纳米给药系统包载siPLKl,尾静脉注射后,由于其纳米效应在肿瘤组织被动富集,并进而通过受体-配体相互作用主动靶向肿瘤细胞,从而实现siRNA药物被动靶向和主动靶向输送的结合,更高效输送siRNA药物到Her2阳性的乳腺癌细胞和组织,有效沉默癌基因PLK1的表达,进而促进肿瘤细胞的凋亡,抑制了肿瘤生长,在动物水平提高了乳腺癌的治疗效果。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-12
第一章 绪论  12-35
  1.1 乳腺癌及其治疗现状  12-14
    1.1.1 乳腺癌发病机制  12-13
    1.1.2 乳腺癌临床治疗手段  13-14
  1.2 RNA干扰现象  14-16
  1.3 siRNA与癌症治疗  16-20
    1.3.1 siRNA的应用  16-17
    1.3.2 siRNA在癌症治疗中的应用  17-20
  1.4 治疗癌症的siRNA输送系统  20-24
    1.4.1 化学修饰的siRNA给药体系  21
    1.4.2 脂质类的siRNA给药体系  21-22
    1.4.3 聚合物类的siRNA给药体系  22-23
    1.4.4 键合和靶向输送siRNA的给药体系  23-24
    1.4.5 物理方法输送siRNA的给药体系  24
  1.5 Her2与乳腺癌治疗  24-28
    1.5.1 Her2的生物学效应  24-25
    1.5.2 Her2抑制剂  25-26
    1.5.3 以Her2为导向的乳腺癌治疗  26-28
  1.6 本论文的选题目的及主要研究内容  28-29
  参考文献  29-35
第二章 Her2单链片段抗体及融合蛋白的表达和纯化  35-53
  2.1 引言  35-36
  2.2 实验部分  36-42
    2.2.1 主要材料  36
    2.2.2 主要药品及溶液配制  36-37
    2.2.3 pET28a-Her2 ScFv-protamine表达载体的构建和蛋白纯化  37-40
    2.2.4 pET28a-Her2 ScFv-cys表达载体的构建和蛋白纯化  40-42
  2.3 结果与讨论  42-51
    2.3.1 F5-P的表达和纯化  42-46
    2.3.2 F5-cys的表达和纯化  46-51
  2.4 本章小结  51-52
  参考文献  52-53
第三章 Her2 ScFv融合蛋白靶向输送siRNA用于Her2阳性乳腺癌的治疗  53-79
  3.1 引言  53-54
  3.2 实验部分  54-64
    3.2.1 主要药品及溶液配制  54-55
    3.2.2 细胞培养  55-56
    3.2.3 琼脂糖凝胶电泳检验F5-P融合蛋白结合siRNA的能力  56
    3.2.4 F5-P融合蛋白输送siRNA到Her2阳性乳腺癌细胞  56
    3.2.5 F5-P融合蛋白输送siDNMTs对DNMTs mRNA表达的影响  56-58
    3.2.6 F5-P融合蛋白输送siDNMTs对DNMTs蛋白表达的影响  58-60
    3.2.7 F5-P融合蛋白输送siDNMTs对RASSF1A甲基化的影响  60-61
    3.2.8 F5-P融合蛋白输送siDNMTs对乳腺癌细胞增殖的影响  61
    3.2.9 原位肿瘤模型建立  61-62
    3.2.10 F5-P融合蛋白在荷瘤裸鼠体内的分布  62
    3.2.11 F5-P融合蛋白输送siDNMTs抑制小鼠原位乳腺癌的生长  62
    3.2.12 肿瘤组织中的DNMTs表达水平和RASSF1A甲基化的检测  62
    3.2.13 免疫组织化学染色检测乳腺癌原位肿瘤细胞凋亡和增殖  62-64
  3.3 结果与讨论  64-75
    3.3.1 F5-P融合蛋白结合siRNA  64
    3.3.2 F5-P融合蛋白将siRNA靶向输送到Her2阳性乳腺癌  64-67
    3.3.3 F5-P融合蛋白输送siDNMTs下调靶基因的表达并抑制RASSF1A甲基化  67-69
    3.3.4 F5-P融合蛋白输送siDNMTs抑制细胞增殖  69-70
    3.3.5 F5-P融合蛋白输送siDNMTs抑制乳腺癌的生长  70-75
  3.4 本章小结  75-76
  参考文献  76-79
第四章 Her2靶向纳米颗粒输送PLK1-siRNA用于乳腺癌治疗的研究  79-108
  4.1 引言  79-80
  4.2 实验部分  80-88
    4.2.1 原料及试剂  80-81
    4.2.2 Mal-PEG-PLA纳米颗粒的制备  81
    4.2.3 Her2靶向纳米颗粒的制备  81-82
    4.2.4 细胞培养  82
    4.2.5 靶向纳米颗粒与Her2亲和力的检测  82
    4.2.6 纳米颗粒包载的siRNA生物学活性检测  82-83
    4.2.7 细胞对靶向纳米颗粒的摄取  83-84
    4.2.8 MTT实验检测包载siPLK1靶向纳米颗粒的生物相容性  84-85
    4.2.9 靶向纳米颗粒输送siPLK1对PLK1 mRNA表达的影响  85-86
    4.2.10 靶向纳米颗粒输送siPLK1对PLK1蛋白表达的影响  86
    4.2.11 靶向纳米颗粒输送siPLK1对癌细胞凋亡的影响  86-87
    4.2.12 靶向纳米颗粒输送siPLK1对癌细胞增殖的影响  87
    4.2.13 原位肿瘤模型建立  87
    4.2.14 靶向纳米颗粒在荷瘤裸鼠体内的分布  87
    4.2.15 靶向纳米颗粒输送siPLK1抑制小鼠原位乳腺癌的生长  87-88
    4.2.16 肿瘤组织中的PLK1表达水平检测  88
    4.2.17 免疫组织化学染色检测乳腺癌原位肿瘤细胞凋亡和增殖  88
  4.3 结果与讨论  88-104
    4.3.1 靶向纳米颗粒的制备和表征  88-90
    4.3.2 乳腺癌细胞的Her2和PLK1表达  90
    4.3.3 靶细胞Her2受体与靶向纳米颗粒的亲和能力  90-91
    4.3.4 包载在纳米颗粒中的siRNA具有良好的生物学活性  91-92
    4.3.5 靶向纳米颗粒高效特异输送siRNA到Her2阳性乳腺癌细胞  92-94
    4.3.6 包载siPLK1的靶向纳米颗粒下调靶基因表达  94-96
    4.3.7 T-NP_(siPLK1)沉默靶基因表达更有效抑制Her2阳性乳腺癌细胞增殖  96-99
    4.3.8 T-NP_(siPLK1)更有效诱导Her2阳性乳腺癌细胞凋亡  99-101
    4.3.9 T-NP_(siPLK1)沉默PLK1基因表达而促进对Her2阳性乳腺癌生长的抑制  101-104
  4.4 本章小结  104-105
  参考文献  105-108
附录一 Her2靶向蛋白的DNA序列  108-110
附录二 实验仪器  110-111
致谢  111-112
在读期间发表的学术论文和取得的研究成果  112-113

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 乳腺肿瘤
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