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可降解高分子纳米颗粒及其作为药物输送载体的研究

作　者: 杜金志
导　师: 王均
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 纳米颗粒 药物输送系统 可降解高分子 树枝状聚合物 环境响应性 癌症治疗 肿瘤干细胞
分类号: TQ460.1
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


纳米颗粒作为药物载体具有重要的应用价值。在肿瘤治疗中,纳米颗粒可有效提高药物的选择性和生物利用度,从而提高肿瘤的治疗效果。但是,设计和制备具有可官能化和敏感性的高分子材料进一步用于构建具有特殊响应性的智能型纳米药物载体依然面临很大挑战。本论文主要集中在环境响应性可降解高分子纳米颗粒的构建及其作为药物载体系统的研究。在论文的第一部分,基于聚磷酸酯可官能化的特点,制备了两种不同结构(AB线性-刷状和ABC线性)的两亲性官能化嵌段聚合物,研究了两种嵌段聚合物形成官能化胶束颗粒的过程,以及它们的生物降解性和相容性。在论文的第二部分,基于各种环境刺激因子,合成了两亲性环境响应性的ABC星型聚合物和一系列Janus树枝状分子,研究了环境刺激所诱导的组装体形貌的变化以及触发的包载物质的响应性释放。在论文的最后部分,基于肿瘤组织和肿瘤细胞特殊的pH环境,构建了pH响应性的纳米药物载体,用于增强肿瘤细胞对载药颗粒的摄取并促进药物的胞内释放。本论文的具体工作包括以下几个方面:1、通过开环聚合,成功制备了两亲性、官能化聚磷酸酯的线性-刷状两嵌段聚合物聚己内酯-b-聚磷酸酯(PCL-b-PPEG)和三嵌段聚合物聚乙二醇-b-聚己内酯-b-聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(mPEG-b-PCL-b-PPEEA)。这是首次获得官能化的聚磷酸酯嵌段聚合物。这两类官能化嵌段聚合物都在水溶液中自组装形成核壳型胶束颗粒,且临界胶束化浓度(CMC)随亲水链段的增加而增大,随疏水链段的增加而降低。实验证实,两类聚合物都具有良好的生物相容性和可降解性,具有作为纳米药物载体的潜力。另外,由于mPEG-b-PCL-b-PPEEA聚合物中聚磷酸酯链段含有氨基,所形成的纳米胶束颗粒具有正电性,我们后续的实验证实它能携载小干扰RNA(siRNA)用于癌症治疗,并有效抑制肿瘤生成,进一步体现了官能化聚磷酸酯材料的重要应用价值。2、提出并证实利用紫外光诱导三臂星形聚合物“脱”臂从而使胶束向囊泡转化的概念。结合开环聚合和点击化学的手段,制备了光敏感的三臂星形聚合物ECE,其中一个聚乙二醇(PEG)亲水链段在UV照射下脱离聚合物,使得聚合物中PEG亲水段的比例显著下降,促使原组装体发生从胶束到囊泡的形貌转变。我们提出的UV敏感性的方法与文献中利用温敏性改变聚合物形貌的方法相比,具有明显优势:(1)将完成形貌转化的时间从长达数周甚至数月缩短至四天,大大提高了聚合物形貌转化的速率;(2)不需外加任何化学或物理手段进行二次交联,转化后的囊泡结构就可稳定存在,且形貌和粒径基本不变,有利于实现此类形貌转变的应用价值。3、通过“模块化”的合成方法,成功制备了分别具有紫外光响应性、还原响应性和pH响应性的两亲性Janus树枝状分子。这是首次关于环境响应的两亲性Janus树枝状分子的报道。在合成过程中各中间产物及最终产物的结构分别使用1H NMR、13C NMR和ESI-MS等进行了验证,并证实所得到的Janus树枝状分子具有预想的敏感性能,表明我们设计的“模块化”合成方法在制备响应性Janus树枝状分子时高效可行,为以后进一步拓展树枝状分子的官能化应用奠定了基础。此外,由于制备的Janus树枝状分子具有两亲性结构,在水溶液中可以组装形成规整的胶束纳米颗粒,并在相应刺激因子的作用下将包载的疏水性分子有效释放,具有进一步作为响应性药物释放载体的潜力。4、在纳米药物载体用于肿瘤治疗所面临的诸多挑战中,如何使具有长循环能力的“惰性”纳米药物载体在肿瘤部位“活化”而更有效进入肿瘤细胞是一直未能有效解决的问题。针对这个问题,我们设计制备了肿瘤酸度诱导的电位反转PAMA-DMMA纳米凝胶颗粒,有望在解决这一矛盾中发挥作用。实验证明,PAMA-DMMA纳米凝胶在血液正常pH条件下呈负电性,几乎不会吸附牛血清白蛋白(BSA),预示着有条件实现长循环并通过增强的渗透和滞留(EPR)效应在肿瘤部位富集,而在肿瘤酸度环境下(文中选择pH 6.8),PAMA-DMMA纳米颗粒在30 min的时间内迅速实现从负电性到正电性的转变,大大增加与蛋白的作用,而且激光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞计数(FACS)检测结果表明发生电位反转的PAMA-DMMA纳米凝胶被人乳腺导管癌细胞系MDA-MB-435s的摄取量显著增加。在体内水平的实验中,我们也证实PAMA-DMMA纳米凝胶能够被肿瘤组织的酸度活化,更多的被肿瘤细胞摄取,而不具备电位反转能力的PAMA-SA纳米凝胶则不能有效进入肿瘤细胞。更重要的是,PAMA-DMMA纳米凝胶还可以通过静电作用装载水溶性抗癌药物阿霉素盐酸盐,载药效率可高达98%,并可有效将药物从载体中释放。细胞增殖抑制实验表明,PAMA-DMMA纳米凝胶载药系统在pH 6.8时具有显著增强的细胞杀伤能力。由此得出结论,具有肿瘤酸度响应的电位反转PAMA-DMMA纳米凝胶颗粒有望作为一种有效的药物载体用于肿瘤治疗。5、为了进一步提高纳米药物载体治疗肿瘤的效果,我们提出以双重pH响应性的纳米颗粒作为药物输送载体的概念。我们结合开环聚合和聚合后修饰的方法制备了既能对肿瘤酸度响应又能对细胞内内涵体/溶酶体响应的聚合物-阿霉素的键合药PPC-Hyd-DOX-DA。在水溶液中,PPC-Hyd-DOX-DA组装成直径在27 nm左右的纳米颗粒。通过电势测定以及药物释放的实验证明,PPC-Hyd-DOX-DA纳米颗粒在细胞外既具有肿瘤酸度(pH 6.8)刺激的从负电性转变为正电性的能力,又具备内涵体酸性促进的阿霉素(DOX)释放能力。CLSM和FACS检测的结果表明PPC-Hyd-DOX-DA纳米颗粒在pH 6.8时进入细胞的能力明显高于在pH 7.4时的情况,进入细胞之后,键合DOX的腙键被内涵体酸性条件(pH 5.0)破坏,促使DOX从载体中释放,而只有单一敏感性的对照组PPC-Hyd-DOX-SA或PPC-Ami-DOX-DA则无法同时实现上述功能。我们在SK-3rd肿瘤干细胞中验证,只有同时具备双重pH响应性的PPC-Hyd-DOX-DA纳米颗粒才表现出显著增强的抑制球囊生成的能力,表明这种双重pH敏感的给药策略在具有耐药性的肿瘤干细胞中可体现出明显的优势,为治疗肿瘤提供了一种新的思路。

全文目录


摘要  5-8
ABSTRACT  8-16
第1章 绪论  16-46
  1.1 纳米药物  16-18
    1.1.1 纳米悬浮液  16-17
    1.1.2 纳米载药系统  17-18
  1.2 纳米载药系统的性能和特点  18-20
  1.3 纳米载药系统的分类和应用  20-29
  1.4 纳米载药系统的发展  29-36
    1.4.1 被动靶向纳米载药系统  29-31
    1.4.2 主动靶向纳米载药系统  31-32
    1.4.3 智能型纳米载药系统  32-36
  1.5 本课题的选题目的及主要研究内容  36-37
  参考文献  37-46
第2章 可官能化聚磷酸酯嵌段共聚物的合成及自组装研究  46-72
  2.1 引言  46-47
  2.2 生物可降解线性-刷状聚己内酯-聚磷酸酯嵌段共聚物的合成及自组装研究  47-58
    2.2.1 概述  47
    2.2.2 实验材料及方法  47-50
      2.2.2.1 实验材料  48
      2.2.2.2 PEG 化磷酸酯单体（PPEG）的合成  48
      2.2.2.3 聚合物PCL-b-PPEG 的合成  48
      2.2.2.4 产物的表征  48-49
      2.2.2.5 PCL-b-PPEG 聚合物胶束的制备  49
      2.2.2.6 PCL-b-PPEG 聚合物胶束临界胶束浓度（CMC）的测定  49
      2.2.2.7 PCL-b-PPEG 聚合物胶束粒径的测定  49
      2.2.2.8 PCL-b-PPEG 聚合物胶束形貌的测定  49-50
      2.2.2.9 脂肪酶催化聚合物胶束的降解  50
    2.2.3 结果与讨论  50-57
      2.2.3.1 聚合物的制备与表征  50-53
      2.2.3.2 聚合物胶束的制备与表征  53-56
      2.2.3.3 聚合物胶束的降解  56-57
    2.2.4 结论  57-58
  2.3 官能化聚乙二醇-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段聚合物的制备及自组装行为的研究  58-69
    2.3.1 概述  58
    2.3.2 实验材料及方法  58-61
      2.3.2.1 实验材料  58
      2.3.2.2 2-（N-叔丁氧羰基胺基）乙氧基-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷单体（PEEABoc）的合成  58-59
      2.3.2.3 聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚（2-氨乙基乙撑磷酸酯）（mPEG-b-PCL-b-PPEEA）的合成  59
      2.3.2.4 产物的表征  59-60
      2.3.2.5 mPEG-b-PCL-b-PPEEA 聚合物胶束的制备  60
      2.3.2.6 mPEG-b-PCL-b-PPEEA 聚合物胶束临界胶束浓度（CMC）的测定  60
      2.3.2.7 DLS 测定mPEG-b-PCL-b-PPEEA 聚合物胶束粒径和表面电位  60
      2.3.2.8 TEM 观察mPEG-b-PCL-b-PPEEA 聚合物胶束形貌  60
      2.3.2.9 MTT 法和“Live/Dead 染色法”测定mPEG-b-PCL-b-PPEEA 的生物相容性  60-61
    2.3.3 结果与讨论  61-69
      2.3.3.1 聚合物的制备与表征  61-64
      2.3.3.2 mPEG-b-PCL-b-PPEEA 胶束的制备与表征  64-67
      2.3.3.3 mPEG-b-PCL-b-PPEEA 的生物相容性  67-69
    2.3.4 讨论  69
  2.4 本章小结  69-70
  参考文献  70-72
第3章 紫外光触发的聚合物胶束到囊泡的形貌转化  72-96
  3.1 引言  72-73
  3.2. 实验材料及方法  73-78
    3.2.1 实验材料  73-74
    3.2.2 4-羟基-5-甲氧基-2-硝基苯甲醛的合成  74
      3.2.2.1 3-甲氧基-4-（苯甲氧基）苯甲醛的合成  74
      3.2.2.2 5-甲氧基-2-硝基-4-（苯甲氧基）苯甲醛的合成  74
      3.2.2.3 4-羟基-5-甲氧基-2-硝基苯甲醛的合成  74
    3.2.3 4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯酚的合成  74-75
    3.2.4 产物（1）的合成  75
    3.2.5 聚乙二醇单甲醚丁二酸酯（mPEG-COOH）的合成  75
    3.2.6 产物（3）的合成  75-76
    3.2.7 α-炔丙基-ω-乙酰基聚己内酯（4）的合成  76
    3.2.8 产物（5）的合成  76-77
    3.2.9 ECE（6）的合成  77
    3.2.10 产物的表征  77
    3.2.11 UV 照射诱导的ECE（6）降解  77-78
    3.2.12 ECE 胶束的制备  78
    3.2.13 UV 照射后ECE 胶束溶液UV-vis 光谱的变化  78
    3.2.14 UV 照射后ECE 胶束的形貌变化  78
      3.2.14.1 DLS 测量  78
      3.2.14.2 TEM 观察  78
  3.3 结果和讨论  78-90
    3.3.1 产物（1）的合成与表征  78-81
    3.3.2 聚合物（3）的合成与表征  81-83
    3.3.3 聚合物（4）的合成与表征  83-84
    3.3.4 聚合物（6）的合成与表征  84-86
    3.3.5 UV 光诱导的ECE 聚合物降解  86-88
    3.3.6 UV 光诱导的聚合物组装体形貌的转变  88-90
  3.4 本章小结  90-92
  参考文献  92-96
第4章 环境响应两亲性Janus 树枝状分子的“模块化”合成及性能研究  96-134
  4.1 引言  96-98
  4.2.实验材料及方法  98-109
    4.2.1 实验材料  98-99
    4.2.2 对甲基苯磺酸2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基乙酯（1）的合成  99
    4.2.3 3,4,5-三（2-（2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基）乙氧基）苯甲酸甲酯（2）的合成  99-100
    4.2.4 3,4,5-三（2-（2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基）乙氧基）苯甲酸（3）的合成  100
    4.2.5 3,4,5-三（2-（2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基）乙氧基）苯甲酰肼（4）的合成  100-101
    4.2.6 N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺（A2）的合成  101
    4.2.7 丙烯酸十六醇酯（A3）的合成  101-102
    4.2.8 A5 的合成  102
    4.2.9 2-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)乙酸（A7）的合成  102-103
    4.2.10 A8 的合成  103
    4.2.11 UV 响应性Janus 树枝状分子3EO-NB-2HA（A1）的合成  103-104
    4.2.12 丙烯酸2-（2-吡啶二硫）乙醇酯（82）的合成  104-105
    4.2.13 83 和84 的合成  105
    4.2.14 还原响应性Janus 树枝状分子3EO-SS-2DA（81）的合成  105-106
    4.2.15 C2 的合成  106-107
    4.2.16 C3 的合成  107
    4.2.17 pH 响应性Janus 树枝状分子3EO-Hyd-2HA（C1）的合成  107-108
    4.2.18 两亲性Janus 树枝状分子胶束的制备  108
    4.2.19 两亲性Janus 树枝状分子响应性降解  108
    4.2.20 两亲性Janus 树枝状分子胶束的粒径和形貌表征  108-109
    4.2.21 尼罗红（NR）的响应性释放  109
  4.3 结果和讨论  109-130
    4.3.1 亲水树枝状部分的合成与表征  109-113
    4.3.2 UV 响应性Janus 树枝状分子的合成与表征  113-119
    4.3.3 还原响应性Janus 树枝状分子的合成与表征  119-125
    4.3.4 两亲性Janus 树枝状分子胶束的制备与表征  125-126
    4.3.5 两亲性Janus 树枝状分子的响应性降解  126-129
    4.3.6 尼罗红（NR）的响应性释放  129-130
  4.4 本章小结  130-131
  参考文献  131-134
第5章 肿瘤酸度触发的电位反转纳米药物载体促进肿瘤细胞摄取的研究  134-160
  5.1 引言  134-136
  5.2.实验材料及方法  136-141
    5.2.1 实验材料  136
    5.2.2 甲基丙烯酸胺乙基酯单体（AMA）的合成  136-137
    5.2.3 交联剂聚乙二醇丙烯酸酯（PEGDA）的合成  137
    5.2.4 PAMA 纳米凝胶的制备  137
    5.2.5 羧基化的PAMA-DMMA 和PAMA-SA 纳米凝胶的制备  137-138
    5.2.6 动态光散射（DLS）研究纳米凝胶的尺寸  138
    5.2.7 原子力显微镜（AFM）研究纳米凝胶的形貌和尺寸  138
    5.2.8 FITC 标记的PAMA-DMMA 和PAMA-SA 纳米凝胶（FITC-PAMA-DMMA 和FITC-PAMA-SA）的制备  138
    5.2.9 PAMA-DMMA 纳米凝胶在pH 6.8 下的降解行为  138
    5.2.10 纳米凝胶在pH 7.4 和6.8 的电位变化情况  138-139
    5.2.11 纳米凝胶在pH 7.4 和6.8 的蛋白吸附  139
    5.2.12 纳米凝胶包载DOX·HCl  139
    5.2.13 DOX·HCl 从纳米凝胶的释放  139
    5.2.14 激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）研究MDA-MB-4355 细胞对FITC 标记纳米凝胶的摄取  139-140
    5.2.15 流式细胞计数（FACS）研究MDA-MB-4355 细胞对FITC 标记纳米凝胶的摄取  140
    5.2.16 载药纳米凝胶抑制MDA-MB-4355 细胞增殖活力的测定  140-141
    5.2.17 纳米凝胶在肿瘤组织的分布  141
  5.3 结果与讨论  141-155
    5.3.1 纳米凝胶的制备和表征  141-145
      5.3.1.1 单体和交联剂的合成和表征  141-142
      5.3.1.2 纳米凝胶的制备和表征  142-145
    5.3.2 PAMA-DMMA 纳米凝胶在pH 6.8 时的降解以及电位变化  145-147
    5.3.3 纳米凝胶的蛋白吸附  147-148
    5.3.4 纳米凝胶在不同pH 下的细胞摄取  148-150
    5.3.5 纳米凝胶包载和释放DOX  150-152
    5.3.6 纳米凝胶在不同pH 下对肿瘤细胞的杀伤能力  152-154
    5.3.7 纳米凝胶在肿瘤组织的分布  154-155
  5.4 结论  155-157
  参考文献  157-160
第6章 双重pH敏感聚合物-阿霉素纳米颗粒同时促进细胞摄取和胞内药物释放的研究  160-184
  6.1 引言  160-161
  6.2.实验材料及方法  161-166
    6.2.1 实验材料  161
    6.2.2 聚乙二醇单甲醚-聚磷酸酯两嵌段共聚物（mPEG-b-PAEP）的合成  161-162
    6.2.3 侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚-聚磷酸酯两嵌段共聚物（mPEG-b-PAEP-Cya，PPC的合成  162
    6.2.4 DMMA 修饰的聚乙二醇单甲醚-聚磷酸酯两嵌段共聚物（PPC-DA）的合成  162
    6.2.5 巯基反应性的阿霉素衍生物Mal-DOX 的合成  162-163
    6.2.6 PPC-Hyd-DOX-DA 聚合物的合成  163
    6.2.7 聚合物的结构表征  163
    6.2.8 PPC-Hyd-DOX-DA 的自组装行为  163-164
    6.2.9 阿霉素载药量的测定  164
    6.2.10 阿霉素的体外释放  164
    6.2.11 流式细胞计数（FACS）研究MDA-MB-231 对PPC-Hyd-DOX-DA 键合药纳米颗粒的摄取  164
    6.2.12 激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察MDA-MB-231 细胞对PPC-Hyd-DOX-DA 键合药纳米颗粒的摄取  164-165
    6.2.13 PPC-Hyd-DOX-DA 纳米颗粒在MDA-MB-231 细胞中的分布  165
    6.2.14 PPC-Hyd-DOX-DA 纳米颗粒对SK-31d 球囊生成的影响  165-166
  6.3 结果与讨论  166-179
    6.3.1 聚合物PPC 的合成及表征  166-168
    6.3.2 聚合物PPC-Hyd-DOX-DA 的合成及组装  168-170
    6.3.3 PPC-Hyd-DOX-DA 的双重pH 响应性  170-173
    6.3.4 细胞水平研究PPC-Hyd-DOX-DA 双重pH 响应性  173-176
    6.3.5 PPC-Hyd-DOX-DA 抑制肿瘤干细胞的球囊生成  176-179
  6.4 本章小结  179-180
  参考文献  180-184
致谢  184-186
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果  186-190

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