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Geminin基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制初探

作　者: 张园园
导　师: 舒茂琴
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: Geminin 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells VSMCs) RNA干扰表型转化细胞增殖 Cdt1
分类号: R541
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

一、研究背景血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖、迁移及其合成细胞外基质是导致动脉粥样硬化、血管成形后再狭窄等增生性血管疾病的共同发病基础，但目前就其具体的发病机制研究得还不甚清楚，有相关报道发现细胞表型的转化是导致启动上述病理过程的关键环节。研究细胞表型转化对血管平滑肌增殖的影响，探讨血管增生性疾病的发病机制已成为该领域的热点，新近发现的一种被称为多功能小分子蛋白Geminin在真核细胞增殖-分化过程中发挥着重要的协同作用。提示这个基因可能参与VSMCs表型转化的调控。但是Geminin对VSMCs增殖影响如何？是否通过调控表型影响增殖？知之甚少。本研究对大鼠血管平滑肌细胞Geminin进行干扰，观察和分析其对VSMCs增殖及其表型的影响。为其运用于动脉粥样硬化及其血管成形术后再狭窄的防治提供一定的实验基础。通常情况下，VSMCs存在两种表型，即去分化表型(合成表型)与分化表型(收缩表型)，在一定的条件下，两种表型可以发生相互转化，正常成人的血管动脉壁由内膜，中膜和外膜三层构成。VSMCs主要位于中膜且呈分化表型，当受到外界的刺激如内皮受到损伤或是体外进行培养时，其表型可由分化型向去分化型转化，并向内膜迁移、增殖。合成型VSMCs分化程度较低，处于这种表型的细胞可以合成血管活性物质和分泌细胞外基质，参与血管损伤的修复，在生长因子刺激下，可发生分裂和增殖。VSMCs表型的转化是其增殖的前提，此外VSMCs的增殖还受起始复合物的调控，而ORC1和Cdt1是起始复合物组成的关键因子，在调节细胞增殖的过程中发挥着重要的生理作用。细胞进行增殖时其表型会发生转化，Geminin是否参与了细胞表型转化的调控，与细胞增殖有何关系？目前认为DNA的复制是细胞增殖的基本特征，而起始复合物是真核生物复制的起始蛋白，在DNA复制的过程中只有起始复合物的成功组建才能确保DNA复制的顺利进行，因此我们推测Geminin可能是通过影响起始复合物的形成从而起到调控VSMCs的表型转化与增殖的作用。二、研究目的1.本研究通过对Geminin基因进行干扰观测该基因对VSMCs表型转化及其增殖的影响。并初步探讨Geminin基因影响VSMCs增殖的相关机制。三、研究方法1．构建三组针对VSMCs Geminin基因的干扰序列并筛选出干扰效果最为显著的序列用于构建慢病毒包裹的稳定干扰模型。2．血清刺激诱导细胞处于分化表型，分别利用RT-PCR，Western blot方法检测VSMCs中Geminin基因、蛋白表达的变化。3．对Geminin进行干扰后，利用Western blot方法检测VSMCs表型标志物的变化并应用[3H]-TdR、EdU掺入试验观测VSMCs增殖的情况。4．通过阻断Geminin基因观测起始复合物ORC1；Cdt1表达的变化，并利用免疫荧光及免疫共沉淀的方法研究两者之间的相互关系。四、研究结果1、将三段针对Geminin基因的干扰序列转染入细胞，检测发现以第1亚组干扰效果最为显著：其表达量较其余两阳性亚组及对照组比较有显著下降，差异具有统计学意义；并将第一亚组干扰序列成功构建慢病毒干扰模型。2、对处于分化表型的VSMCsGeminin进行干扰，检测其不同表型标志物的变化发现：收缩型表型标志物α-actin明显下降，合成型标志物OPN表达显著升高，初步验证Geminin基因参与了VSMCs表型转化的调控。3、VSMCsGeminin基因沉寂后,与两对照组相比较，阳性干扰组的[3H]-TdR和EdU掺入量显著增加，说明Geminin基因可抑制VSMCs的增殖。4、对Geminin基因进行沉默后，与空白及阴性对照组相比较，阳性干扰组中起始复合物ORC1，Cdt1的表达量有显著增加，免疫荧光及免疫共沉淀结果提示Geminin蛋白与Cdt1蛋白存在着直接相互作用.。五、结论Geminin基因与VSMCs表型转化及增殖密切相关，Geminin对VSMCs增殖的调控可能是通过影响起始复合物的顺利形成而实现的，说明Geminin参与调控了DNA的复制的启动。并在此过程中起到重要的平衡作用。

Geminin基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制初探

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