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RNA干扰抑制水通道蛋白3对肠粘膜上皮屏障影响的实验研究
作 者: 张文杰
导 师: 徐泽宽
学 校: 南京医科大学
专 业: 普通外科学
关键词: 水通道蛋白 RNA干扰 肠粘膜屏障 紧密连接 Caco-2
分类号: R363
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
下 载: 51次
引 用: 0次
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内容摘要
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目的：探讨RNA干扰下调人AQP3基因表达对肠粘膜上皮屏障的影响，并探讨其可能的作用机制。方法：在Caco-2细胞系中检测AQP3基因的表达，构建沉默AQP3mRNA表达的shRNA慢病毒载体，转染Caco-2细胞系，建立稳定转染细胞系，荧光定量PCR以及Western blot验证其在mRNA和蛋白水平的干扰效率。体外建立肠粘膜上皮屏障，分为实验分为三组：空白对照组（CON）、阴性对照组(NC)、AQP3干扰组(RNAi)，分别在第7，14，21，28天检测细胞跨膜电阻（TEER），荧光黄(Luciferyellow，LY)的通透性和易位的大肠杆菌（E.coli C25）的数量。Western blot验证紧密连接（TJ）相关蛋白的表达情况。并且采用免疫细胞化学法观察紧密连接相关蛋白，如Occludin蛋白，Claudin-1蛋白的分布和结构变化。结果：荧光定量PCR及Western blot结果显示shRNA慢病毒载体可有效沉默AQP3在Caco-2细胞系中的表达，与空载质粒组相比，RNA干扰组在第7，14，21天TEER明显降低，荧光黄的通透性增大并且易位的大肠杆菌（E.coli C25）的数量明显增多，各检测时间点RNAi组和空载质粒组比较均存在统计学差异（P﹤0.05)。Western blot结果显示AQP3干扰组紧密连接相关蛋白Occludin以及Claudin-1的表达明显降低。免疫细胞化学结果显示Caco-2细胞间Occludin以及Claudin-1主要表达在细胞膜和/或胞浆中，相邻Caco-2细胞间TJ结构遭到破坏。结论：靶向AQP3的shRNA技术通过对AQP3的有效沉默可明显降低肠粘膜屏障的完整性，为进一步探讨肠粘膜屏障损伤治疗提供新的思路。
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全文目录
序言 5-7
摘要 7-9
Abstract 9-11
前言 11-12
材料与方法 12-23
结果 23-31
讨论 31-35
小结 35-36
参考文献 36-39
文献综述 39-57
参考文献 49-57
附录 57-58
攻读学位期间发表文章情况 58-59
附件 59-71
致谢 71
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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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