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游离脂肪酸受体1（GPR40）MAPK信号通路与内吞机制研究

作　者: 武春
导　师: 周耐明
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: GPR MAPK 游离脂肪酸胰岛β细胞内吞作用胰岛素分泌受体结合 clathrin 脂肪酸受体 ERK 高浓度葡萄糖 insulin 细胞分泌 glucagon EGFP 偶联蛋白激酶信号途径磷酸化处理低血糖的
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

脂肪酸不仅仅是人体的能量来源,同时也参加一系列的生理活动,比如免疫反应和胰岛素分泌。2003年,三个独立的研究小组发现一系列的中长链脂肪酸能够激活孤儿G蛋白偶联受体GPR40。紧接着GPR40被命名为游离脂肪酸受体1 (FFAR1). GPR40仅在高浓度葡萄糖的存在下能够促进胰岛β细胞葡糖依赖性的胰岛素分泌,从而降低了低血糖的风险,因此成为非常重要的治疗2型糖尿病的靶标。了解调控GPR40的信号通路为GPR40生理功能的阐述及糖尿病的药物设计提供理论的基础。因此我们的研究着力于研究GPR40受体激活后内吞的转运机制。我们构建了融合GFP的表达载体,并筛选得到稳定表达GPR40-EGFP受体的单克隆HEK293稳定细胞株。荧光显微镜下观察发现,GPR40-EGFP主要分布在细胞膜上,也有很大部分位于胞内。在配体100μM LA的刺激下,受体分布发生改变,集中到细胞核周围,成点状聚集分布。后期研究发现GPR40的内吞主要通过clathrin依赖型的途径并受arrestin-3的调控。有趣的是,我们发现GPR40受体的本底细胞内表达水平很高,而clathrin和arrestin-3的knockdown并不影响GPR40受体的本底性内吞,暗示GPR40受体配体依赖性和不依赖性的内吞机制并不相同。所有的G蛋白偶联受体都能够促进MAPK的信号级联反应,参与调控细胞增殖和凋亡。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAP激酶,MAPK)链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一,其中细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular regulated protein, ERK)为MAPK家族重要成员。ERK1/2信号途径对细胞的分裂、迁移和细胞凋亡等起到调控作用,如GLP-1受体信号转导能够通过ERK1/2途径抑制胰岛β细胞的凋亡。糖尿病产生的重要原因之一是胰岛素β细胞的损伤,因此,研究GPR40如何调控ERK1/2途径以及ERK1/2途径是否参与胰岛β细胞的增殖和凋亡过程具有重要的生理意义。第三章的实验研究中,我们着力于解决GPR40介导的ERK1/2磷酸化。通过利用稳定转染GPR40受体的HEK293细胞和内源性表达的β-TC-6细胞,我们发现在HEK细胞中,LA能够通过Ca2+/ PKC和Gi途径激活ERK1/2。考虑到脂肪酸受体的同源性,我们的研究也会给脂肪酸受体家族的其他受体提供参考和依据。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-6
Abstract  6-8
英文缩写词表  8-11
第一章文献综述  11-18
  1.1 糖尿病的危害性及新药研发策略  11-12
    1.1.1 全球糖尿病及中国糖尿病现状  11-12
    1.1.2 以胰岛GPCR作为糖尿病新药靶标已成为重要的研发策略  12
  1.2 胰岛β细胞中内源性表达GPCR的研究进展  12-15
    1.2.1 促进胰岛素分泌的GPCR  12-15
    1.2.2 抑制胰岛素分泌的GPCRs  15
  1.3. 胰腺细胞GPCR信号转导研究进展  15-17
    1.3.1 G蛋白偶联受体对胰腺细胞功能的影响  15-16
    1.3.2 G蛋白偶联受体对胰岛β细胞生长的影响  16-17
  1.4 GPR40受体(游离脂肪酸受体1)信号通路的研究进展  17-18
第二章人GPR40受体的内吞及胞内转运机制  18-38
  2.1 前言  18-19
  2.2 材料与方法  19-24
    2.2.1 实验材料  19-21
    2.2.2 实验方法  21-24
  2.3 实验结果  24-36
    2.3.1 GPR40-EGFP与野生型GPR40在HEK293细胞中的功能鉴定  24-25
    2.3.2 GPR40的组成型内吞及配体依赖型内吞  25-29
    2.3.3 网格蛋白(clathrin)对GPR40配体依赖型内吞和组成型内吞的影响  29-31
    2.3.4 Arrestin-3参与GPR40配体依赖型的内吞,却并不影响组成型内吞  31-33
    2.3.5 内吞GPR40受体的再循环  33-36
  2.4 讨论  36-38
第三章 GRP40受体介导的MAPK信号通路研究  38-50
  3.1 前言  38-39
  3.2 材料和方法  39-40
    3.2.1 实验材料  39-40
    3.2.2 实验方法  40
  3.3 实验结果  40-48
    3.3.1 GPR40-EGFP受体的功能鉴定  40-41
    3.3.2 GPR40介导的ERK1/2磷酸化通过Ca~(2+)/PKC途径,而Gβγ,PKA和PLD并不参与其中  41-45
    3.3.3 GPR40介导的ERK1/2磷酸化可能与Gi有关  45
    3.3.4 EGFR,Src,PI3K抑制剂及arrestin-2,3对GPR40介导的ERK1/2磷酸化的影响  45-47
    3.3.5 在β-TC-6细胞中,LA时间依赖性的降低ERK1/2的磷酸化  47-48
  3.4 讨论  48-50
参考文献  50-58
Curriculum Vitae  58-59

游离脂肪酸受体1（GPR40）MAPK信号通路与内吞机制研究

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