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人源性乳腺微环境小鼠模型的移植物功能研究

作　者: 吴丹
导　师: 王水
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 人源性乳腺癌小鼠模型微环境
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

乳腺癌发病率日益增长，严重威胁女性生命健康。对于乳腺癌发病机制及防治的研究广泛开展，动物模型这一体内研究工具在乳腺癌的研究中有着重要的作用。目前应用较多的小鼠模型有着各自的优缺点，最主要的缺陷是不能提供人源性微环境。微环境是一个由多种成分构成的支持性网络，其在肿瘤中的重要性日益得到重视。本实验室利用SCID（严重联合免疫缺陷）小鼠先后建立了人乳腺-人乳腺及人乳腺-人骨乳腺癌原位及转移模型，除了能更好的模拟肿瘤发生及转移的各个过程之外，均提供了人源性组织特异性的微环境。为了对人源性系列模型的优势做进一步的理解和阐释，更为了对模型本身各项参数进行定量，以便于该模型更好的被运用，我们采用多种技术手段，对人源性移植物在小鼠体内从适应、恢复、正常维持至衰老的过程中，其结构和功能的变化和适宜使用时间做了监测和研究。本研究中，我们按照构建模型的标准操作将人乳腺组织植入SCID小鼠，之后每周牺牲小鼠并取出体内移植的正常人乳腺组织，分别进行HE染色常规病理观察，透射电镜观测及Calponin、P63、Ki67、芳香化酶（Aromatase）和类固醇硫酸酯酶（steroid sulfatase, STS）的免疫组织化学染色。同时留取小鼠乳腺脂肪垫进行了对比。另外，我们设置了“肿瘤植入组”，将新鲜人乳腺癌组织移植在SCID小鼠皮下，观测植入8周后肿瘤组织在小鼠皮下的改变。术后第1周小鼠植入部位的乳腺已被形成的包膜包裹，植入的组织触感柔软，随植入时间的增长，植入组织体积逐渐缩小变韧。HE染色下人乳腺植入小鼠体内后形态变化具有一定趋势：植入最初几周上皮细胞肿胀变形，腺体结构模糊，这种变化在第1-3周逐渐加重，腺体及上皮细胞形态在第2-3周时达到最差，从植入第4周开始，腺体形态出现好转，上皮细胞内脂肪变性减少，细胞核形态规则，5周时腺体与植入前的腺体形态接近，此后13周，植入的腺体及上皮细胞结构保持基本正常的腺管结构。光镜下植入后组织间质始终呈现纤维化和玻璃样变性，这种变性并不像腺体结构具有随时间的变化趋势。透射电子显微镜观察到与普通光学显微镜相符的变化趋势，结构先变差再恢复：1周的上皮细胞细胞核形态明显异常；2周细胞脂肪变性明显，细胞内可见大量脂肪空泡，核内也可见到脂质包涵体，胞质内细胞器不明显；3周时胞质内线粒体肿胀明显；4周线粒体肿胀消退，线粒体嵴清晰；5周开始上皮细胞间隙清晰可见，且能观测到腺上皮标志性的桥粒连接，胞质内细胞器丰富，此后数周上皮细胞维持此种类似正常乳腺上皮细胞的结构直至观测终点。我们在6周的标本中观测到了类似妊娠后期乳腺上皮表现的细胞，胞质内细胞器丰富，并且有大量小泡且向腔内分泌，内含两种不同电子密度的物质。除大体标本见到的包膜血管网之外，光镜及电镜均可见到血管结构。HE切片中血管内可见红细胞，提示这些血管具有正常功能。Calponin及P63是肌上皮细胞的标志物，可提示局部乳腺微环境稳定性。正常参照中腺管周围有完整的肌上皮细胞包围。但植入后1-2周的标本中，腺管周围Cal部分表达缺失，提示肌上皮细胞出现缺失，胞核染色指标P63无明显变化。Ki67在植入前和植入后的乳腺腺体中均呈散在表达，并未随植入时间的推移出现明显的表达增高和表达缺失的情况。局部产生雌激素的两条途径的限速酶芳香化酶（Aromatase）和类固醇硫酸酯酶（steroid sulfatase, STS）抗体在移植前及移植后各时间点的乳腺组织中均呈现染色阴性。本实验选用的均是未经交配的小鼠，故小鼠的乳腺组织始终处呈现静止期乳腺的表现，脂肪垫内主体为脂质成分，中间夹杂导管结构，导管周围可见少量间质细胞，切片中未见腺泡结构。随实验进行，小鼠乳腺结构未出现时间相关性改变。肿瘤植入组共接种6只小鼠，6例成瘤均失败，随植入时间的增长肿块均明显缩小，手术取出的肿块体积明显小于植入前。HE染色下移植后的人乳腺癌组织周围及内部可见血管，血管内可见到红细胞。肿瘤组织周围有包膜，肿瘤生长局限在包膜内，部分肿瘤中心出现坏死区域。正常人乳腺组织在移植到小鼠体内后经历了适应期（1-3w）—恢复期（4w）—正常结构维持期（5w-13w）—衰老期四个阶段的时间相关性变化。恢复期后，小鼠体内的人乳腺组织可在相当长的时间内维持人类正常乳腺结构，包括腺体结构、细胞结构、亚细胞结构、血管结构均符合在体内的正常状态。此外人乳腺组织在小鼠体内能保留正常乳腺组织在相关激素的刺激下泌乳的功能。免疫组织化学染色显示出移植的人乳腺基底膜-肌上皮稳定性也发生了从适应到恢复正常的时间相关性变化。Ki67表达稳定，提示人乳腺组织在小鼠体内增殖性保持稳定。Aromatase及STS染色均呈阴性，提示移植后的人乳腺组织并未在局部合成雌激素，其维持自身结构和功能及促进激素受体阳性肿瘤细胞成瘤的主要因素仍值得深入探究。小鼠MFP结构特征及肿瘤植入组成瘤失败提示小鼠MFP及皮下与人体乳腺癌发生环境差异较大，不适于乳腺癌生长转移；在小鼠皮下种植的正常人乳腺组织可以存活，不但能长期保持正常的组织结构及功能，还能产生特定的发育改变，尤其提示乳腺正常微环境和肿瘤微环境差别巨大，在选择模型时，应结合研究目的充分考虑这一点。

全文目录

摘要  6-9
Abstract  9-14
前言  14-16
材料与方法  16-25
  一、研究对象  16-17
    1. 标本及其来源  16-17
    2. 实验动物  17
  二、标本处理、移植手术及取材方法  17-20
    1. 仪器、试剂及药物  17-18
    2. 标本处理及移植手术  18-19
    3. 取材及标本处理  19-20
  三、乳腺组织 HE 染色下形态学观察  20-21
    1. 制备组织蜡块  20-21
    2. 组织切片制备  21
    3. 组织切片 HE 染色  21
    4. 观测  21
  四、乳腺组织免疫组化指标观测  21-22
    1. 观测指标及抗体  21-22
    2. 免疫组化 SP 法染色  22
    3. 显微镜下观测各指标表达情况  22
  五、乳腺组织透射电镜观测  22-25
    1. 透射电镜标本标本制备  22-23
    2. 超薄切片制备  23-24
    3. 透射电镜观察  24-25
结果  25-39
  一、植入正常乳腺组织大体观察性状随时间的变化  25
  二、植入正常乳腺组织腺管结构随时间的变化  25-29
  三、植入正常乳腺组织细胞结构随时间的变化  29-33
  四、正常乳腺植入组血管结构的变化  33-35
  五、正常乳腺组织 IHC 结果  35-37
  六、小鼠乳腺脂肪垫的 HE 染色结果  37-38
  七、乳腺癌组织植入小鼠体内后大体观察  38
  八、移植后乳腺癌组织 HE 染色结果  38-39
分析与讨论  39-43
结论  43-44
参考文献  44-47
综述  47-66
  参考文献  56-66
附录  66-67
致谢  67-68

人源性乳腺微环境小鼠模型的移植物功能研究

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