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肝素前体多糖的分离纯化研究

作　者: 杨明康
导　师: 钱捷
学　校: 浙江工业大学
专　业: 药物化学
关键词: 肝素前体多糖分离纯化
分类号: R284.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

肝素前体多糖是脊椎动物在催化合成肝素的过程中产生的前体物质,该物质经过一系列的硫酸化及异构化修饰后即可合成肝素。本研究以E.Coli K5发酵液为原料,对肝素前体多糖的提取除杂、分离纯化、检测以及结构鉴定进行了研究。研究结果如下：1.采用有机溶剂沉淀的方法,经过提取得到的肝素前体多糖粗品为淡黄色粉末物质,其糖醛酸含量为23.9%；对提取的粗多糖进行了除杂工艺研究,优化了双氧水氧化法脱色和Sevage法除蛋白的工艺条件。经综合考虑双氧水氧化法脱色的最佳条件为：双氧水浓度为1.5%,温度为25℃,时间为3h,多糖的脱色率为67.35%；Sevage法除蛋白的最佳工艺条件为氯仿：正丁醇(V/V)为4：1,样品：试剂(W/W)为1：1,萃取时间1Omin,萃取次数为3次,在此条件下多糖的除蛋白率为76.59%。2.研究了乙醇沉淀法对多糖纯化效果的影响。结果表明,当heparosan多糖浓度为14%(W/V)、Nacl浓度为3%(W/V)、乙醇浓度为70%(V/V),重复沉淀4次时,纯化物中的葡萄糖醛酸含量可达44.52%(W/W),多糖的得率为43.50%(W/W)。3.研究了壳聚糖沉淀法对多糖纯化效果的影响。当壳聚糖用量为4.0mg时,得到沉淀的多糖回收率为94%(W/W)。沉淀继续纯化得到多糖纯品,其糖醛酸含量为45.69%,得率为40.36%。4.研究了DEAE Sepharose fast flow离子交换法对多糖纯化效果的影响。经过该法纯化的多糖其糖醛酸含量为49.35%,得率为38.52%。5.对多糖的糖醛酸含量、纯度、分子量和理化性质进行了检测和鉴定。硫酸-咔唑法测糖醛酸含量的最优条件是：水解温度为25℃、硼砂-硫酸用量为4mL、水解时间为20min、咔唑-乙醇用量为0.15mL、显色时间为10min。通过重现性实验、稳定性实验以及回收率实验证明了这一方法的可靠和准确。采用高压凝胶渗透色谱法(HPGPC)对多糖的纯度和分子量进行了鉴定,结果表明离子交换法得到的多糖纯度最高(接近100%),其分子量为4.5x104Da；并对多糖的理化性质进行了分析,结果符合该多糖的相关特征。6.通过紫外、红外、核磁、单糖组成、二糖结构几个方面对肝素前体多糖的结构进行了鉴定,结果表明其分子结构为[→4)β-D-葡萄糖醛酸(1→4)α-D-N-乙酰-葡萄糖胺(1→]n。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-14
第一章文献综述  14-30
  1.1 肝素前体多糖的研究概况  14-16
  1.2 肝素前体多糖的提取与除杂  16-22
    1.2.1 肝素前体多糖的提取研究  17-19
    1.2.2 肝素前体多糖的除杂研究  19-22
  1.3 肝素前体多糖的纯化与检测  22-27
    1.3.1 肝素前体多糖的纯化  22-24
    1.3.2 肝素前体多糖的检测  24-27
  1.4 肝素前体多糖的结构分析  27-28
  1.5 研究内容、目的及意义  28-30
    1.5.1 研究内容  28-29
    1.5.2 研究目的及意义  29-30
第二章肝素前体多糖的提取与除杂工艺研究  30-39
  2.1 前言  30
  2.2 实验材料  30-32
    2.2.1 原料  30
    2.2.2 试剂  30-31
    2.2.3 仪器与设备  31-32
  2.3 实验方法  32-35
    2.3.1 肝素前体多糖的提取  32
    2.3.2 双氧水氧化法脱色正交实验  32-33
    2.3.3 蛋白质含量的测定  33-34
    2.3.4 Sevage法除蛋白正交实验  34-35
  2.4 实验结果  35-38
    2.4.1 肝素前体多糖的提取结果  35
    2.4.2 双氧水氧化法正交试验结果  35-36
    2.4.3 蛋白质标准曲线的绘制  36
    2.4.4 Sevage法除蛋白正交实验结果  36-38
  2.5 本章总结  38-39
第三章肝素前体多糖的纯化方法研究  39-52
  3.1 前言  39-40
  3.2 实验材料  40-41
    3.2.1 原料  40
    3.2.2 试剂  40
    3.2.3 仪器与设备  40-41
  3.3 实验方法  41-44
    3.3.1 乙醇沉淀法  41-42
    3.3.2 壳聚糖沉淀法  42-43
    3.3.3 DEAE Sepharose fast flow离子交换法  43-44
  3.4 结果与讨论  44-50
    3.4.1 乙醇沉淀法  44-48
    3.4.2 壳聚糖沉淀法  48-49
    3.4.3 DEAE Sepharose fast flow离子交换法  49-50
  3.5 本章总结  50-52
第四章肝素前体多糖的检测  52-68
  4.1 前言  52
  4.2 实验材料  52-54
    4.2.1 原料  52-53
    4.2.2 试剂  53
    4.2.3 仪器与设备  53-54
  4.3 实验方法  54-58
    4.3.1 硫酸-咔唑法测多糖中的糖醛酸含量  54-56
    4.3.2 高压凝胶渗透色谱法鉴定多糖的纯度  56
    4.3.3 肝素前体多糖分子量的测定  56-57
    4.3.4 肝素前体多糖理化性质的鉴定  57-58
  4.4 结果与讨论  58-67
    4.4.1 硫酸-咔唑法测多糖中的糖醛酸含量  58-63
    4.4.2 高压凝胶渗透色谱法鉴定多糖的纯度  63-65
    4.4.3 肝素前体多糖分子量的测定  65-66
    4.4.4 肝素前体多糖理化性质的鉴定  66-67
  4.5 本章总结  67-68
第五章肝素前体多糖的结构鉴定  68-80
  5.1 前言  68
  5.2 实验材料  68-69
    5.2.1 原料  68
    5.2.2 试剂  68-69
    5.2.3 仪器与设备  69
  5.3 实验方法  69-72
    5.3.1 紫外光谱分析  69
    5.3.2 红外光谱分析  69-70
    5.3.3 核磁共振波谱分析  70
    5.3.4 单糖组成分析  70-71
    5.3.5 二糖结构分析  71-72
  5.4 实验结果  72-79
    5.4.1 紫外光谱分析  72
    5.4.2 红外光谱分析  72-73
    5.4.3 核磁共振波谱分析  73-76
    5.4.4 单糖组成分析  76-77
    5.4.5 二糖结构分析  77-79
  5.5 本章总结  79-80
第六章结论与展望  80-82
  6.1 结论  80-81
  6.2 展望  81-82
参考文献  82-90
致谢  90-91
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