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银条多糖分离纯化、抗肿瘤和免疫调节活性研究

作　者: 马丽苹
导　师: 曾晓雄
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物工程
关键词: 银条多糖超滤分离纯化理化性质免疫调节抗肿瘤
分类号: R284
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

银条(Stachys floridana Schuttl. ex Benth)是唇形科水苏属多年生蓄根草本植物,分布于华北、华南和新疆等地,多处于半野生状态。人工栽培主要集中在河南偃师,占全国栽培总量的95%以上。然而目前对银条的研究主要涉及其繁育、栽培及贮藏保鲜等方面,而对银条中活性物质研究开发较少,尤其多糖方面的系统研究几乎没有。鉴于此,本研究以偃师银条为原料,分别对其多糖提取工艺及超滤浓缩、分离纯化、理化性质、抗肿瘤活性和免疫调节活性进行了研究。主要结果如下：1银条多糖提取工艺及超滤浓缩的研究选择提取温度、提取时间、液料比及提取次数4个因素分别进行单因素实验,在单因素实验基础上,选择提取温度、提取时间及液料比3个参数进行三因素三水平的Box-Behnken实验(BBD),对此3个参数的实验组合进行优化,通过Design-Expert软件对数据进行处理,得出银条多糖的最优提取条件为提取温度94℃,提取时间4h,液料比19mL/g。在此条件下银条多糖的提取率为9.98±0.60%。选择50kDa超滤膜,以膜通量为指标,首先研究了操作压力、超滤温度和料液pH值3个工艺参数对银条提取液超滤效果的影响,并在此基础上通过正交实验确定超滤浓缩的最佳工艺参数,最后通过测定清洗前后膜通量的变化确定最佳的超滤膜清洗方法。结果表明：最佳超滤工艺参数为操作压力0.35MPa,操作温度30℃,料液pH6.5；最佳清洗方法为40℃下用pH值为8.5的NaOH溶液清洗0.5h；超滤浓缩效果优于常规浓缩。2银条多糖分离纯化、理化性质及初步结构分析采用DEAE-纤维素阴离子交换柱色谱法和葡聚糖G-100凝胶过滤柱色谱法对银条多糖进行分级纯化,获得一个主要纯化组分SFPSA,得率是12.57%。采用HPLC法对SFPSA的纯度进行进一步鉴定,结果表明SFPSA是均一的多糖组分,其相对平均分子量为：168.30kDa。采用苯酚硫酸法,以混合糖为标准品测定SFPSA的总糖含量78.41±5.11%,比单用葡萄糖为标准品测定的结果(56.17%±3.94%)要高,而且混标法测定SFPSA中总糖含量重现性好,平均回收率可达97.85%,12h内结果稳定。分别采用间羟联苯法、氯化钡-明胶法、考马斯亮蓝法对SFPSA中糖醛酸含量、硫酸基含量、蛋白质含量进行了测定。结果表明,SFPSA中糖醛酸含量25.20±1.88%,硫酸基含量1.98±0.21%和蛋白质含量分别为1.28±0.04%。分别采用糖腈乙酰化法和PMP柱前衍生化法测定SFPSA单糖组成。结果表明,糖腈乙酰化法测定的SFPSA中含鼠李糖,阿拉伯糖,葡萄糖和半乳糖等单糖组分,其摩尔百分比为8.19：37.74：3.46：50.61；PMP柱前衍生化法测定的SFPSA主要由六种单糖组成,分别是鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GlaA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(G1a)和阿拉伯糖(Ara),其摩尔百分含量比为7.75：1.65：14.92：1.87：33.17：40.64,该结果说明SFPSA是一种主要由半乳糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖组成的杂多糖。而且,PMP柱前衍生化法能够更加全面的反映样品的单糖组成。红外光谱扫描表明,SFPSA具有多糖特征吸收峰,而且具有β-吡喃糖苷键的特征吸收峰。紫外光谱扫描结果显示,SFPSA在280nn处没有显著的吸收峰,这表明SFPSA中蛋白质含量很低。3银条多糖抗结肠癌活性及其机理的初步研究采用MTT法考察了SFPSA对三种肿瘤细胞株(BGC-823、HGC-27和HT-29)增殖的抑制作用,并选取其中对SFPSA最敏感的肿瘤细胞株,进一步研究SFPSA对该细胞株增殖抑制作用的机理。实验结果表明,SFPSA能抑制这三种肿瘤细胞的增殖,且这种抑制作用均呈现一定的浓度和时间的依赖性。另外,给药72h后,SFPSA对三种肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为3662.24μg/mL、1136.73μg/mL、407.52μg/mL,由此可见,人结肠癌HT-29细胞对SFPSA最为敏感。细胞形态学研究证明SFPSA可以显著的抑制人结肠癌HT-29细胞的生长,且随剂量的增长细胞密度逐渐下降,细胞间隙变大,失去“群集”特性,最后失去粘附性而死亡。Hoechst33258染色后,荧光显微镜观察显示其细胞核内出现凋亡碎片,即呈现显著的凋亡特征,这表明SFPSA处理可以引起人结肠癌HT-29细胞凋亡。FITC-Annexin V/PI双染色和流式细胞仪检测结果表明,经SFPSA处理HT-29细胞48h后,随着SFPSA处理浓度的增加,HT-29细胞的凋亡率从11.3±2.07%上升到47.4±0.98%。细胞周期分析结果显示,经SFPSA处理HT-29细胞48h后,随着SFPSA处理浓度的增加,HT-29细胞中G0/G1期细胞比例从42.35±3.21%下降到24.38±4.01%,而G2、M期细胞比例从31.57±2.18%上升到56.84±4.12%,表明SFPSA可以通过在HT-29细胞中产生G2/M阻断,使其无法进入有丝分裂过程而促使其进入凋亡过程。采用荧光定量PCR分析SFPSA对HT-29细胞中凋亡相关基因Bax、Bcl-2和p53的mRNA表达水平的影响。结果表明,SFPSA处理HT-29细胞48h后,随着SFPSA处理浓度的增加,促凋亡成员Bax和p53的mRNA相对表达水平上升,与对照相比,前者分别增加了1.21倍和1.67倍,后者分别增加了1.26倍和1.74倍。而抑凋亡成员Bcl-2的mRNA相对表达水平下降,与对照相比,分别下降了3.79倍和11.3倍。另外,分光光度法研究Caspase-3活化度的结果表明,HT-29细胞经SFPSA处理48h后,细胞中Caspase-3被活化。根据以上结果,我们可以推断SFPSA处理HT-29细胞后,可能通过上调p53表达,进而诱导Bax表达增加和Bcl-2表达减少,最后引起Caspases的级联放大反应而最终导致细胞凋亡。4银条多糖免疫调节活性运用体外细胞模型实验研究了SFPSA的体外免疫调节活性。结果表明：SFPSA能促进小鼠脾淋巴细胞增殖,促其释放IFN-y,且能活化小鼠腹腔巨噬细胞,促其释放免疫活性分子NO和IL-6,增强其酸性磷酸酶活性和吞噬中性红的能力。而且SFPSA的这种体外免疫调节能力具有双向性,即在低浓度下具有免疫促进作用,而在高浓度下则开始表现为不同程度的免疫抑制作用。采用环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型研究了SFPSA的体内免疫调节活性。结果显示,SFPSA可以使因环磷酰胺(Cy)诱导产生的免疫功能低下得以恢复,具体表现为SFPSA处理可以显著地提高脾脏指数、迟发型超敏反应(DTH)的耳肿胀度、脾脏和血清中溶菌酶(LZM)的活性和血清中溶血素水平,且这种变化与SFPSA呈现剂量依赖关系。这些结果表明,SFPSA不仅能够提高免疫抑制小鼠的非特异性免疫能力,还可以提高其特异性免疫能力。

全文目录

摘要  10-13
ABSTRACT  13-17
缩略语说明  17-20
第一章绪论  20-54
  1 水苏属植物及银条的研究概况  20-21
    1.1 水苏属植物的化学成分及其药用价值  20
    1.2 银条的生物学特性及研究现状  20-21
  2 植物多糖的研究概况  21-39
    2.1 植物多糖的提取  22-25
    2.2 植物多糖的分离纯化  25-28
    2.3 植物多糖的定量测定方法  28-32
    2.4 植物多糖的生理活性  32-39
  3 本文的立题依据与主要研究内容  39-40
    3.1 立题依据  39
    3.2 主要研究内容  39-40
  参考文献  40-54
第二章银条多糖提取及超滤浓缩工艺的研究  54-76
  1 材料与方法  55-59
    1.1 实验材料  55
    1.2 主要仪器设备及试剂  55
    1.3 实验方法  55-59
  2 结果与讨论  59-72
    2.1 提取温度对银条多糖得率的影响  59-60
    2.2 提取时间对银条多糖得率的影响  60-61
    2.3 提取液料比对银条多糖得率的影响  61
    2.4 提取次数对银条多糖得率的影响  61-62
    2.5 响应面法优化多糖提取条件  62-66
    2.6 银条多糖提取液的超滤  66-72
  3 本章小结  72-73
  参考文献  73-76
第三章银条多糖分离纯化、理化性质及结构表征  76-100
  1 材料与方法  76-84
    1.1 实验材料  76
    1.2 主要仪器设备及试剂  76-77
    1.3 实验方法  77-84
  2 结果与讨论  84-96
    2.1 银条多糖的分离纯化  84-85
    2.2 银条多糖SFPSA的基本理化性质  85-90
    2.3 SFPSA的结构表征  90-96
  3 本章小结  96-97
  参考文献  97-100
第四章银条多糖抗结肠癌活性及其机理的初步研究  100-126
  1 材料与方法  100-108
    1.1 材料与试剂  101
    1.2 仪器与设备  101-102
    1.3 实验方法  102-108
  2 结果与讨论  108-118
    2.1 银条多糖SFPSA体外对三种肿瘤细胞增殖的抑制作用  108-111
    2.2 SFPSA对结肠癌HT-29细胞形态学的影响  111-112
    2.3 FITC-Annexin V/PI染色法检测SFPSA对结肠癌HT-29细胞凋亡率的影响  112-114
    2.4 流式细胞仪检测SFPSA对结肠癌HT-29细胞细胞周期的影响  114-116
    2.5 SFPSA对HT-29细胞中凋亡相关基因Bax、Bcl-2及p53的mRNA表达的影响  116-118
    2.6 SFPSA对HT-29细胞中Caspase-3活性的影响  118
  3 讨论  118-122
    3.1 SFPSA对肿瘤细胞增殖的抑制作用  118-119
    3.2 SFPSA对人结肠癌HT-29细胞的细胞形态学影响  119-120
    3.3 SFPSA诱导结肠癌细胞HT-29凋亡的机理  120-122
  4 本章小结  122-123
  参考文献  123-126
第五章银条多糖的免疫调节活性研究  126-152
  1 材料与方法  127-134
    1.1 材料与试剂  127
    1.2 仪器与设备  127-128
    1.3 实验方法  128-134
  2 结果与分析  134-142
    2.1 银条多糖SFPSA的体外免疫调节活性  134-138
    2.2 SFPSA体内免疫调节活性  138-142
  3 讨论  142-146
    3.1 SFPSA的体外免疫调节作用  142-144
    3.2 SFPSA的体内免疫调节作用  144-146
  4 本章小结  146
  参考文献  146-152
结论与展望  152-156
论文创新点  156-158
附图  158-160
致谢  160-162
博士期间发表论文和申请专利情况  162

银条多糖分离纯化、抗肿瘤和免疫调节活性研究

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